[转移帖]摘录——WHO佐剂疫苗非临床评价指导原则非正式咨询会
原帖由论坛会员Rojjer发表于 2013-2-1 09:432012年11月27日至11月28日参加了在瑞士日内瓦召开的关于佐剂疫苗非临床评价指导原则非正式咨询会（WHO Informal Consultation on Guideline for Nonclinical Evaluation of Adjuvant Vaccines）。以下部分是从中检院网站中摘录的会议相关内容，有兴趣的朋友可以学习学习。
本次会议回顾了指导原则的全部内容，并对指导原则的适用范围、佐剂疫苗的化学、生产和质控信息、新佐剂及佐剂疫苗的概念性研究、非临床评价动物实验及相关的实验动物模型等关键问题开展了热烈的讨论。下面对该指导原则的主要内容和本次会议讨论的焦点问题介绍如下：
1、该指导原则的适用范围
该指导原则主要适用于为传染性疾病防治而研发的佐剂疫苗，包括预防性疫苗和治疗性疫苗，但不包括治疗非传染性疾病（如癌症和过敏）的治疗性疫苗。与会专家一致同意：由于抗原、佐剂和抗原/佐剂制剂的复杂性，佐剂本身不会得到授权，其必须作为某种含佐剂疫苗的组分去申请授权，而且每一种新的含佐剂疫苗都应当视为一种新的独立制品，需要进行适当的理化特性、非临床和临床评价才可获批。但从相似产品获得的已有数据可为非临床和临床研究提供重要指导信息。
2、候选佐剂和含佐剂疫苗所需的化学、生产和质控（CMC）信息
为了确保抗原和佐剂具有合适的质量，生产控制（如质量、含量、纯度及效力等）及其控制范围在研究阶段和商业化生产阶段、以及不同临床实验阶段均不尽相同。在早期临床实验中，应开发合适的分析方法并予标准化。通常包括鉴定和定量检测一种复杂的含佐剂疫苗中的各种组分（包括抗原、佐剂、其他重要组分以及疫苗中的添加剂）、评价与佐剂活性相关的特性（如外观、颗粒大小和颗粒大小分布、聚集物的存在、抗原吸附的完全性以及pH）、评价抗原/佐剂兼容性和含佐剂疫苗各组分间物理相互作用等。当然，评价疫苗成品效力的QC实验也是必须的，但效力试验可反映也可不反映佐剂对于含佐剂疫苗效力的贡献大小，如果效力实验不反映佐剂的贡献，评价疫苗成品中或单独包装的佐剂中佐剂的含量就很重要。应该注意的是，在非临床研究中所使用的抗原、佐剂和含佐剂疫苗的批次在生产、理化性质、效力和稳定性方面应与临床用苗相当并具有很好的代表性。在后期临床研究中，生产者应特别关注成品生产过程有无任何微小的变化，并评价这些变化能否影响产品安全性。随着临床研究和产品研发的进行，生产者应当提供对关键步骤、中间产品以及初期接受标准进行控制的信息，以确保生产过程在各关键点可控。生产者应提供充分证据确保临床研究将产生可靠的可解读的数据。
3、非临床评价应选择相关实验动物模型对疫苗佐剂和含佐剂疫苗进行安全性和免疫原性研究
对影响佐剂和含佐剂疫苗的安全性和免疫原性研究，应选择合适的动物模型。选择时通常应考虑如下几点：1）给药途径：毒理学评价所用的给药方式应当与临床实验一致，如临床试验使用特殊器械进行给药，动物实验也尽可能使用相同器械；2）基线免疫状态：应明确界定与安全性评价最相关的基线免疫状态；3）理想的动物模型应能重复出人体产生的免疫反应；4）能够得到的历史性数据。在大多数情况下，对于新的佐剂和含佐剂疫苗，一种相关动物模型就足够了。但何为相关模型，是个十分复杂的问题，也是本次会议讨论的焦点之一。理想状态下，选择的动物应当对疫苗所抵抗的细菌、病毒或寄生虫抗原具有易感性。关于灵长类动物的选择，专家认为，当有其他种类动物可供使用时，没有必要使用非人灵长类动物。另外应该注意，由于动物对抗原或佐剂的反应特异性，使用动物模型预测人类免疫反应具有局限性，而且动物研究可能无法检测到那些罕见的副反应。
4、佐剂使用的原则和概念性研究
不同抗原的特性不相同，对佐剂免疫学帮助的需求也不同，选择佐剂应基于所想产生的免疫反应类型，并应有足够的科学研究结果，支持佐剂对疫苗抗原诱导免疫反应的增强效应以及佐剂疫苗的安全性，这部分研究被称为“概念性研究”，包括体内研究和体外研究。体内研究通常包括剂量范围和配比研究，前者用来评价不同含量的佐剂和抗原，以发现抗原/佐剂的最优比例，从而发挥抗原最大优势并确定抗原和佐剂剂量的安全性。根据所使用的不同抗原和佐剂，研究主要包括以下内容：1）评价体液免疫反应的强度（如抗体平均滴度或浓度）、质量（抗体亲和力）以及活性作用（即中和活性）；2）评价细胞免疫，包括对某种特异的细胞免疫反应诱导的评价，如Th1和Th2型反应、可检测细胞因子和细胞毒性T细胞的诱导等；3）评价合适动物模型中的保护作用； 4）阐明佐剂作用模式和免疫调节作用的机理。上述研究结果将有助于解读非临床安全性研究，并确定将来临床研究中将被检测的潜在副反应。体外功能性实验可为了解佐剂的作用模式提供帮助，可提供有价值的补充性数据，如通过检测抗原递呈细胞表面受体表达量的改变以及细胞因子的分泌，可对佐剂的作用效果进行评价。值得一提的是，这些甄选含佐剂疫苗制剂的试验性和探索性研究可能并不符合GLP，但这些研究可以鉴定未知或潜在的副反应并为遵从GLP的毒理学研究提供重要信息。
5、药物非临床安全性评价动物实验
安全性评价动物实验对于确定合适的佐剂/抗原比例和安全剂量、免疫方法和给药途径，以及确定临床试验初期需检测的未知或潜在不良反应非常重要。由于抗原、佐剂和佐剂疫苗的最终制剂均有可能导致安全问题，佐剂疫苗的安全性评价应包括单独佐剂的毒性研究和佐剂疫苗的毒性作用。
5.1单独佐剂的毒性研究
单独佐剂（或复合佐剂中单独组分的评价）的毒性未必需要单独开展一个评估程序，可通过在重复剂量毒性研究中加入单独佐剂免疫组。单独佐剂的毒性研究（如系统毒性和基因毒性）通常应在临床试验前进行，但发育和生殖毒理学研究也可在临床试验同时进行；如果试验对象是怀孕个体，单独佐剂和佐剂疫苗的发育和生殖毒理学研究必需在临床试验前进行。由于许多佐剂具有高水平的种属特异性，因此，佐剂的毒性研究必需在相关物种上进行。
评价的主要内容包括：（1）药代动力学研究：生物分布和药代动力学研究有助于理解佐剂作用的过程和结果。（2）毒性概念研究和正式研究：佐剂的安全性评价数据通常由佐剂的概念研究或GLP毒性研究中获得，佐剂的概念研究可能并不符合GLP，但佐剂疫苗最终制剂的毒性研究必须在正式的GLP框架内进行。（3）基因毒性和致癌性研究：根据ICH要求，只有新合成的化合物佐剂需要做遗传毒性研究，且需要一套标准的遗传毒性试验；但寡脱氧核苷酸被认为不具有遗传毒性风险，可不做遗传毒性实验；由于佐剂免疫剂量低，次数少，其致癌风险极小，因此，佐剂或佐剂疫苗一般无需致癌性研究。（4）安全性药理学研究：可以证明其对生理功能及免疫系统无不良影响。
5.2佐剂疫苗最终制剂的毒性研究
佐剂疫苗最终制剂的非临床毒性研究用于评价疫苗的局部反应原性和全身毒性，进而发现和确定疫苗潜在的不良反应，以推断疫苗安全性是否达到临床试验要求。其中，重复剂量毒性研究最为重要，通常应在一种适当物种（主要是敏感物种）中进行，必要时，可按照不同产品选择额外物种进行试验。佐剂疫苗最终制剂的重复剂量毒性研究应全面考虑，周密设计，如下因素需要重点关注。
5.2.1剂量、给药方案和对照组设立
应该采用候选疫苗动物试验中能引起适当免疫反应的最佳剂量。不同于化学药物，疫苗剂量反应评价一般不作为基本毒性评估的一部分，其致死剂量也不需确定；但对新型佐剂，通过不同剂量研究确定一期临床试验安全剂量是非常必要的。另外，临床最高人用剂量应在动物安全性试验中进行评估。关于重复给药的次数，如果临床给药次数为一到两次，则其动物模型毒性研究所选给药次数应比临床给药次数多一次（N+1）；如果临床给药次数为三次或更多，毒性研究所选给药次数可以等于人用次数。为了模拟临床用量，疫苗剂量一般不变，但给药间隔可以减少，非临床给药间隔应主要取决于动物研究中观察到的初级和二级抗体反应的动力学。给药途径应与临床试验尽可能一致（包括一些辅助器械）。研究设计应包括阴性对照组，以确定治疗基线水平。如果合适的话，还可设阳性对照组。另外，在重复给药研究中，还应包括一个额外治疗组，以评估治疗期间所发现不良反应的可逆性和检测延迟发生的潜在不良反应。
5.2.2试验终点
试验终点的选择对重复给药毒性研究至关重要，终点的选择很大程度上取决于研究类型和待评价具体制品。通常，佐剂疫苗的潜在不良反应应从靶器官、剂量、暴露途径、持续时间和频率以及毒性作用的潜在可逆性等方面进行评价。
有关全身毒性检测参数，重复给药毒性研究应关注引流淋巴结等部位的局部炎症反应和免疫等系统的全身毒性反应，收集包括活体和非活体数据。同时进行免疫反应评估，以确认预期免疫应答在毒性研究中的发生。由于疫苗接种时会发生局部炎症反应，因此应监测动物的体重、进食量、体温、凝血参数和急性期反应物等参数等。对佐剂疫苗而言，建议每天都进行体重和进食量测量，特别是在每次给药后的第一周，这些参数的反应较为敏感。给药一周后，检测频率可适当降低。首次和末次给药后1至3天和恢复期结束时，应考虑进行血液学和血清生化中期分析，并对未给药阴性对照样品进行收集。在特定情况下，凝血参数、尿液样本和血清免疫球蛋白类型等参数的评价可能是很有价值的。免疫接种前，佐剂或佐剂疫苗给药后24至48小时、和恢复期7天后的毒性研究急性反应物的检测，可以帮助预测可能的全身毒性。非活体数据（如完整的验尸数据）应在最后一次免疫后两天内和恢复期内收集。研究结束时，要收集空腹时的最终体重。最终的血液采集和分析应包括血清生化学和血液学和免疫反应的评价，适当情况下也要检测免疫类型。组织病理学检查应包括关键的器官（脑、肺、心、肾、肝和生殖器官），佐剂或佐剂疫苗免疫要特别要注意免疫器官，如淋巴结（离接种点近和远的淋巴结），胸腺、脾、骨髓和淋巴结或支气管相关淋巴组织，以及可能主要由于特定的给药途径影响的器官。对于粘膜佐剂以及包含粘膜佐剂的疫苗，建议进行完整的组织检测。
有关局部检测参数，应在接种部位和任何其它因免疫方法发生接触的相关部位进行检测，多次给药更应关注“局部累积毒性”评价。应通过前瞻性的系统评价注射部位反应，包括评估任何水疱、溃疡、严重焦痂的形成和肢体障碍等其它毒性的发生。接种位点和其它佐剂或佐剂疫苗接触位点，也应进行病理组织学评价，注射部位和周围解剖结构的浸润免疫细胞的类型和程度和组织损伤均应进行评价和报告。
如果接种对象包括育龄妇女，应考虑疫苗的发育和生殖毒性。佐剂疫苗可能会因其引起的固有免疫反应而导致不良反应和炎症反应的增加，进而有可能增加孕期风险、影响胎盘的植入和生长。为了评估佐剂疫苗的孕期潜在影响，应该选用怀孕动物接种疫苗，并研究受精卵着床到怀孕结束期间疫苗引起的反应。实验端点的胚胎和围产后毒性研究内容有包括：生育能力、流产、胎儿体重和形态等。由于啮齿类动物孕期转入胚胎的抗体很少，需要进行2/3阶段的组合研究，建议包括至少9至10天泌乳期。此阶段老鼠的成熟度与人类新生儿出生时相同。
除了临床实验前进行上述毒性评价外，对某些佐剂，有必要在临床试验同时进行医学额外的非临床安全性评价。如多年内多次接种含同种佐剂的疫苗（同种疫苗或不同疫苗），该佐剂在被用于多个疫苗前，应进行佐剂的额外安全性研究；如疫苗的计划接种人群包含弱体质对象（如新生儿），则更应考虑额外的安全评价研究，如幼年动物研究可能有助于识别生殖毒性评价中未发现的产后发育毒性；此外，还应该考虑自身免疫问题，但这是一个十分复杂的问题，当前尚没有合适的自身免疫病动物模型足以被用作对新佐剂的疫苗筛选模型。
6、临床评价早期考虑因素
除了与一般疫苗类似的早期临床试验考虑因素外，新型佐剂疫苗临床评价尚有其独特的问题需要考虑。（1）尽管一个佐剂疫苗的早期临床试验并不需要阴性对照组，但这类接种了无活性盐安慰剂的对照组有助于初始安全数据的解释。但从伦理角度，应尽量避免单独佐剂对照组，而首选安慰剂和单独抗原制剂组。（2）制造商应该提供疫苗中使用佐剂的理由，包括有关添加佐剂好处的临床前研究信息（如概念验证研究、攻击模型数据）、有/无佐剂疫苗的早期临床安全性和免疫原性研究数据及其增强免疫反应和节约抗原的数据等。（3）由于佐剂本身可能诱发极强的固有免疫反应，以及佐剂对抗原的增强免疫反应均可导致不良事件，评价时应予充分关注。（4）由于新型佐剂可能诱导自体免疫或自身炎症疾病，建议在新型佐剂的临床试验中，对所有治疗组受试者迟发性自身免疫疾病相关的严重不良事件进行监测，检测时间建议扩展到疫苗接种后12个月，但临床研究报告的提交和后继临床研究的启动不需因随访而推迟。
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