dalc999 发表于 2016-2-26 10:58:53

构建好的重组杆状病毒如何鉴定目的基因有没有重组进去？

最近用英俊公司的bac-to-bac同时构建了两个重组的杆状病毒，没挑单斑之前的P1代杆状病毒已经做到了表达这一步，两个病毒表达目的蛋白的情况挺好的。但是我从P1代病毒开始挑的单斑往下扩的时候，可能是标记搞混了（原谅我非常低级的错误），挑的单斑的病毒扩起来之后，检测表达，western和ELISA和结果显示有几个单斑搞混了。非常悲剧。
我现在想鉴定这几个单克隆的病毒，想用PCR的办法，但是用我以前构建病毒的时候用的引物来PCR，模板用这几株病毒收获液，却发现PCR不出来，同时用质粒和E.coli.做阳性对照能PCR出来，这是为什么？昆虫的杆状病毒不是DNA病毒吗？为什么会PCR不起来？
有没有谁有经验的？其它的什么方法可以鉴定吗

ipsvirus 发表于 2016-2-26 14:53:00

"模板用这几株病毒收获液"是上清病毒？是不是病毒滴度太低了，你上清抽提的病毒基因组量不够。

douban 发表于 2016-2-27 16:33:51

本帖最后由 douban 于 2016-2-27 16:36 编辑

Bacmid DNA的PCR鉴定
由于Bacmid DNA中含有M13的正向及反向引物序列，在转作子两端，所以可以用M13来扩增鞭毛蛋白基因。
M13 Forward :5-GTTTTCCCAGTCACGAC-3
M13 Reverse :5-CAGGAAACAGCTATGAC-3
反应的条件为：93℃ 3min，（94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 5min）×25-35个循环，72℃ 7min。
2.2.5 取5-10μL PCR产物，0.7%琼脂糖电泳检测片段的大小，正确的片段大小为插入片段长度+2400bp左右。



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