稳定转染攻略：从G418浓度确定到单克隆化鉴定
一、筛选之前确定G418浓度：1.由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1 g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722 g。2.G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。neo就是编码3'磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。3.汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%。4.G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100 ug/ml~1 mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48 h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。二、加药时间和维持浓度：1.由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早;但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢,G418的浓度和活性都会下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。这时药物浓度可以降至200 ug/ml。2.加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。一般是转染48小时后加入抗生素。挑出单克隆后就可以用维持浓度，一般是筛选浓度的1/2。关于维持浓度，有人说细胞会出现对抗生素的抗性，应不断提高其浓度。而且，如果你要挑选到几个阳性克隆中较高表达的克隆的话，可以调整抗生素的浓度。当然，抗性基因高表达，目的基因不一定就跟着高表达。三、筛选时的培养液：加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。这时会出现两个问题：1.死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡，因此要及时换液。2.孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。这个时候需要一种特殊的培养液：假如你要转染3T3细胞，在3T3细胞汇合度达到80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养液按1：1混合备用。再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。3.适当增加血清浓度。四、筛选时出现的问题及其解决办法：问题1：做hela细胞的筛选，现在已经筛选3周，在6孔板中已经长出一些细胞簇，想把它挑到96孔板中，就用2 ul胰酶消化，在消化过程中，胰酶扩散，细胞已经四散开，和周围的其它细胞簇融合在一起(我的细胞簇离的很近)，就是说几个细胞簇被胰酶融合在一起，那样根本没有办法做下去了，该怎么办?a、可以减少胰酶量;胰酶在加入之前要用37度温箱预热，并且PBS润洗细胞层，以减少可能残存的血清的影响;b、加入胰酶后，稍过几秒钟就可以吸走消化液了，不用吸干净，然后放到37度温箱中继续作用1MIN，这时，消化酶可以继续作用的，又可避免胰酶扩散;c、显微镜下观察细胞完全松散开，就可以在你感兴趣的局部加培养基，并吸走你的可隆了呀;d、具体消化的时间，你注意摸索一下，如果在步骤2中显微镜下见细胞尚未完全松散开，可以再重复的，直到松散开，能够被吸走为止。我的建议：1、在100 mm dish中挑克隆，细胞分的稀一点。2、把细胞全部消化下来，在96孔板中逐步稀释获得单克隆。问题2：筛选成功的概率：只要有抗性加压筛选，挑选到的机率还是比较大的。一般能挑到稳定表达的概率我认为大概有70-80%，但是想挑到表达量高且能稳定表达的，不大容易。这个可能是在染色体上，合适的整合位点太少的缘故。问题3：细胞形态的改变：稳定转染后阳性克隆均出现不同程度的细胞形态的改变。想请教各位有经验的高手，你们做稳定转染时有此发现吗?我的也是，而且好象还有好几种不同类型的细胞。不过，我转的是一种抑癌基因。问题4：单克隆化的时机和个数：加药筛选时， 一般等到确认的转染细胞长到70%以上时，再做有限稀释法， 以克隆出阳性细胞， 同时要保持适当的药物浓度，以防突变和污染。若细胞长好了，如有40%以上，就可以有限稀释了一般，筛选5，6个克隆就有需要的克隆，但保险起见，筛10个吧。从单克隆化时开始，就要加大营养，血清和生长因子。五、单克隆化的操作方法：方法1：单克隆细胞的培养就是这样的，我现在作了15个96孔板的单克隆，总共才得到大约50株单克隆在做时候应保证每个孔中的细胞是一个，因此，我一般在200毫升的培养液中加入小于96个的细胞，这样平均到每个孔中因该可以由满意的结果你所说的现象我也遇到过，我也百思不得其解，只好做多一点的96孔板来补充。培养SPC-A1(人肺癌细胞)，转染了EGFP，然后进行了G418抗性筛选和96孔板单克隆筛选，最终获得了成功将我的实验步骤写出来，希望对你有所帮助。方法2：实验步骤大致为：预先对96孔板除第一排之外的所有孔加含15%胎牛血清的细胞培养液，0.1 ml/孔，并放于细胞培养箱中温育，然后胰酶消化稳定表达GFP的细胞，细胞液稀释至密度为1000 cell/ml的单细胞悬浮液，上述细胞液接种于96孔板的第一排，0.2 ml/孔，从中吸取0.1 ml细胞溶液接种于第二排，混合后，从第二排中吸取0.1 ml接种于第三排……，一直到第八排，最后一排都丢弃0.1 ml细胞液，操作示意图见下图。一般来说，每一列都会有某个孔中只有1~2个细胞。方法3：我的改进之处：我在显微镜下观察，标记孔中小于10个细胞的孔，然后在显微镜下用记号笔在皿底把单个荧光细胞圈住，然后在操净台里用灭过菌底牙签将圈外的细胞戳死，这样留在孔中的就是单克隆了，通过这样的，我一共获得了6株单克隆。但需注意的是：时间不能超过30min，否则细胞极容易死亡。解决操作时间长的方法：拿一个96板，在里面随便种一些细胞，然后用牙签练习，我练了5～6次后非常熟练了培养液：最好是含15%的胎牛血清，加大营养，有利于细胞生长;另外一种方法是对还没有变黄的细胞液进行过滤，过滤后的培养含有很多生长因子，可以作为单克隆的培养液。方法4：我曾经帮同事做过挑单克隆，直接将倒置显微镜搬到操净台内紫外照射30分钟，然后先在显微镜下把要挑的单克隆初看一遍，算一下大概要挑几个，然后在96孔板内先加好培养基，再将6孔板内的培养基吸出，加入少量的胰酶，大概能盖住板底即可，然后在显微镜下观察细胞状态，在有些变圆时，即用10 ul枪在显微镜下直接吸克隆，放入事先准备好的加了培养基的96孔板内，先吸大的克隆，在胰酶完全起到作用使细胞松散扩散开了时，已经吸了将近十个克隆了，动作快一些时能吸十几个克隆，我做过几次了效果很好，没有出现污染。(在要进行操作时，用酒精将手好好擦擦，将显微镜用新洁尔灭也擦一下，一般不会有什么问题)，你可以试试，只要小心一些就行了。方法5：关于稳转的方法，好像园子里很多研究者都用的是有限稀释法来作，但是我们实验室基本上都不用九十六孔做有限稀释来作单克隆的，一般的做法都是这样：（1）3.5 cm皿铺细胞，长到大概80%以上的时候作转染。（2）转染后一天消化，传到一个大皿(1：6)或者两个大皿(1：12)。（3）再过一天后加入带G418的培养基。（4）依据细胞不同，大概从加入G418的第三天到第八天之间细胞开始出现大量死亡，活下来的细胞就形成单克隆。（5）单克隆长到相对较大的集落后，于显微镜下用200 ul枪挑取细胞集落，一般挑上48个，种在两块24孔板上。（6）于24孔板上继续培养，约4、5天后即可消化传代，取部分作收蛋白western之用，根据western结果确定真阳性。我们基本上都是这样pick stable的，除非一些对细胞生长抑止作用强大或者apoptosis的inducer之类的基因比较难挑到stable外，一般还都能挑到stable.当然，转染效率不能太低，超过50%就相对比较容易了，10%以上的可能最后形成的细胞集落就少，而且真阳性也较少。对于那些转染效率很低的细胞，我会连续转染三次(中间如果细胞长满了就传代)，好像比较有效。除非是类似带GFP这样能直接观察到是否真阳性的基因，我们才用有限稀释法来作，要不好像也太麻烦了吧?耗时也多。六、单克隆化后细胞特点和处理：1.单克隆后细胞生活习性改变：考虑质粒的表达对细胞的生长有一定的影响，查文献确认一下。2.单克隆后的培养需要多加些血清，再传代时保证板子不影响细胞贴壁，避免出现传代后细胞浮起来后死亡的现象。3.筛选成单克隆后，不加药培养2代，再加药继续筛选两代，此时如果不出现死亡细胞则可以认为是稳定细胞系。复苏后加G418传代2次，然后按部就班。4.过一段时间再筛选时，G418的浓度有人认为需要比稳转时小写，此外，加药后对蛋白质的表达，细胞形态有影响，因此做功能时要停药培养合适时间后再做。5.稳转PA317细胞后再此筛选(需要隔一段时间再加压筛一次)，细胞也是死的厉害，不过还是可以筛到，不过需要用合适的浓度。可以在细胞传几代后，分出一小部分，不加G418培养一段时间，然后再加你维持细胞的抗性的G418浓度培养一天看细胞会不会死亡，如果死亡，说明外源基因还没有丢失。6.有人这样做的：转染加药一段时间后，板子上出现了几个克隆，如果有几十个克隆，然后挑其中七八个克隆到24孔板里继续加药筛选，等24孔长满后再转到6孔板继续加药筛选，6孔板里长差不多满后，每孔消化下来大概一半做WB鉴定目的基因表达，剩一半留着继续加药培养，等WB结果出来有阳性的孔就保留下来，阴性的丢掉。七、单克隆化后鉴定：1.稳定转染细胞，通过PCR鉴定，发现目的基因并不上调，瞬时转染表达是增高的。原因：瞬转是在强启动子下，稳转时你得到的细胞株可能失去了此启动子，或者是改变了细胞的生理特性!用WB和瞬转对照鉴定一下!2.转染后质粒整合到基因组是随机的，一般两月后(传代10代以上)还表达你想要蛋白的单克隆可以认为是整合了质粒的。
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