呼吸道感染快速床旁诊断的进展和前景
2014 年 11 月，Lancet Infect Dis 上发表了“新出现的呼吸道感染”系列文章，共 5 篇，其中第 4 篇主要描述了现有的呼吸道感染病毒和细菌病原体的诊断试验，以及有望提高床旁快速诊断质量、速度和可操作性的技术发展。现将主要内容编译归纳如下。
呼吸道感染由多种病毒和细菌病原体引起，是全球发病和死亡的第二大常见病因。在全球疾病负担的排名中，下呼吸道感染仅次于缺血性心脏病位居第二。欧洲的监测报告显示，由耐药细菌所致的感染数量显著增加。社区获得性肺炎、医院获得性肺炎和通气相关肺炎不断地给临床诊断和治疗带来巨大挑战。
此外，全球广泛传播的多药耐药结核和新出现的多药耐药革兰阴性菌因缺乏有效的治疗方法而成为人们关注的重点。在日渐庞大的免疫功能低下人群中，呼吸道感染也是最常见的感染，此类人群的条件致病菌感染进一步给鉴别诊断造成困难。
只有通过快速、敏感和特异地识别病原体及其耐药谱，从而开展以循证为基础的有效抗微生物治疗和病原体特异性感染控制措施，才能在所有类型的医疗保健机构中获得呼吸道感染治疗的成功。目前已经能够利用呼吸道样本中的微生物核酸进行靶标的扩增以鉴定微生物及其耐药性。
一、临床和公共卫生诊断
当呼吸道感染患者就诊于任何医疗机构时，应同时具备诊断试验以鉴别感染是由细菌（包括结核）、病毒还是其他微生物引起的，从而获得最佳的治疗效果。目前，对于急性呼吸道感染患者，主要针对细菌感染采取经验性抗生素治疗，而非直接针对致病病原体的治疗。
现阶段，在呼吸道感染临床处理方面存在的主要问题是缺乏标准化、快速、准确、特异性的床旁诊断试验，用于筛查重要病原体、识别致病病原体和明确抗微生物药物的敏感性。当前分子技术的进步为填补这一空白提供了很好的机遇。
过去 10 年中出现了许多新的致命性呼吸道病毒和细菌，它们具有广泛传播的潜力，威胁着全球的健康安全，从而吸引了众多媒体和政府的关注。这些呼吸道病原体包括重度急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、猪流感病毒（H1N1pdm2009）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）、多药耐药和广泛耐药结核分枝杆菌、泛耐药革兰阴性和革兰阳性菌、免疫功能低下患者中的耐药巨细胞病毒株和唑类耐药真菌。
其他新出现的具有流行潜力需要密切监测的呼吸道病原体包括禽流感病毒 H7N9、变异型猪流感病毒 H3N2v 和 H1N1v、人腺病毒 14p1 和 C 型鼻病毒。这些病毒均导致了令人担忧的局部感染暴发。
当一种既往未知的潜在致命性呼吸道感染病原体出现时，临床医生、微生物学家和公共卫生部门应通力合作，在国家和全球卫生系统的协助下应对这一威胁。
应对策略由多个部分组成：快速诊断和识别相似病例；开展病例对照研究以明确储存宿主、传播方式和危险因素；收集单个病例和聚集性病例的数据和报道；明确传播模式；分离、鉴定和描述特定病原体，如果可能的话建立柯赫法则；开发病原体特异性诊断试验和基因组测序以监测其演变和传播模式。
这些合作项目对识别特定微生物、指导合适的靶向治疗、监测治疗反应、预测预后、指导感染控制措施及制定公共卫生监测和控制推荐非常重要。公共卫生部门在处理由新的潜在致命病原体所致的呼吸道感染时，快速、准确的诊断试验是关键。
二、床旁检测和患者近旁检测
呼吸道感染对理想的床旁检测和患者近旁检测的要求相似（表 1），但根据医疗机构的需求不同可能有所差异。
表1.jpg
多种诊断平台和试验都很有可能改善呼吸道感染的处理。而且，这些方法在应对人畜共患病原体（能够跨越物种屏障而广泛传播）所致的呼吸道感染暴发中具有越来越重要的地位。多种采用上述技术且有望大大缩短微生物感染诊断周期的商用诊断试验和平台已经上市或正在研发中（表 2）。表2.jpg
通常为自动化或半自动化的系统或试剂盒，整合了样本制备、病原体检测和耐药基因鉴定等步骤，并自动产生读数。这些试验和平台采用最先进的系统，在整个过程中几乎不需要用户控制，并且能够同时检测多种病原体。根据不同的试验，可以检测单个或多个病原体或耐药性。
这些系统不仅可以提供更快的诊断，还可以提高检测敏感性。然而，这些试验的开发及其在临床实践中的成功实施需要进一步研究。
虽然多重检测结果的准确性高，但为了提供诊断和流行病学信息，集中检测可能更为理想，常规的诊断实验室可以考虑履行公共卫生的职能。在繁忙的三级医疗机构、门诊或发展中国家的乡村，需要将多重分子检测移至实验室以外，作为床旁检测。
此时，一种方法的基本要求可能出现差异：对于现场研究，使用的扩增技术可能需要更适合那些供电无法保证的场合，如等温扩增。对于所有的床旁检测，操作简单便于非实验室专职人员的使用以及对原始信号数据的准确解读是关键。
三、呼吸道感染诊断方法的演变
在实验室检测诞生前，医疗实践是一门艺术，呼吸道感染的诊断主要依靠询问病史和体格检查。Antonie van Leeuwenhoek（1632-1723）发明显微镜是实验室诊断试验发展的第一步，通过痰染色镜检和痰琼脂培养（后续采用液体培养方法）进行呼吸道感染的诊断。
细菌和病毒培养方法的进一步改进提高了检测特定病原体和确定其对特定抗微生物药物敏感性的能力，但培养所需时间（24-72 h）不会影响入院时的治疗决策。这些诊断方法直至 20 世纪 80 年代晚期才发生改变，当时在分子生物学、免疫学、基因组学和技术工程领域出现了重大进展，从而诞生了许多新的诊断试验。
目前已经开发了多种诊断试验用于各种病原体，包括检测微生物抗原或抗体的血清学试验、凝集试验、补体结合试验、荧光抗体试验、放射免疫法和 ELISA。这些试验对呼吸道感染的临床处理没有显著影响。最有意义的进展是将核酸扩增技术（NAAT）用于呼吸道感染的诊断。
目前已经能够利用呼吸道样本（痰、鼻咽拭子、气道吸出物和支气管肺泡灌洗液）中的微生物核酸，对特异性遗传靶标进行扩增。该方法最初需要耗费很多劳力，目前 NAAT 技术已经发展到实时 PCR（rtPCR）、环介导扩增（LAMP）、核酸序列依赖性扩增和链替代扩增，后 3 种方法避免了热循环。
四、病毒感染的诊断试验
1. 病毒诊断方法的演变
在 NAAT 技术出现前，病毒性呼吸道感染的诊断主要依赖于血清学，包括采用补体结合试验检测抗体水平的显著升高、采用免疫荧光或比色法检测病毒抗原和细胞培养分离病毒，这些检测常常没有结果，需要通过免疫荧光或血球吸附进行二次检测。在出结果的时间并不重要的情况下，较早的病毒检测方法可能仍然有用。
在过去 20 年中，随着基因组扩增技术的发展，呼吸道病毒检测的敏感性和特异性得到了提高。目前已经发现了多种新的呼吸道病毒，而敏感的 PCR 方法在诊断流程中得以保留。技术的进步促使了多重 PCR 检测的开发，该方法在一份 PCR 混合物中使用多个引物，其完成时间较多次单靶点 PCR 短。
单一和多重 PCR 可以快速检测临床样本中的呼吸道病毒，并且用于确定新出现的病毒（如甲型流感 H1N1pdm2009 病毒和 2012 年的 MERS-CoV）的流行病学。多重 PCR 可以在一次检测中鉴定出多种不同病毒。目前市面上已有多个多重 PCR 检测方法，并且在不断地改良和评估。
病毒性呼吸道感染的基本实验室诊断方法与分型、抗病毒药物耐药性、核苷酸多态性和病毒载量检测相结合，可以为呼吸道感染的最佳治疗提供更广泛的信息。
2. 病毒诊断方法的特征
一种试验是否适用于临床取决于其相对敏感性和特异性及出结果的时间。单克隆抗体直接荧光抗体试验往往对一种特殊病毒具有足够的特异性，但需要在检测时间和敏感性之间权衡。因此，虽然一些用于直接抗原检测的比色法可以控制在 1 小时内完成，但敏感性约为 70%。反应化学的进一步发展促使能够在一次反应中实现对其他病毒的靶向扩增，同时维持较高的敏感性和特异性，并且检测时间仍能满足临床需要。现有的内部和商业开发的多重检测能够同时对一份临床样本中多达 20 种病原体进行扩增，但其中一些检测需要花费一整天。目前已发表了多项头对头比较内部检测试验和商用检测试验的研究。
3. 病毒多重检测的临床解读
多重检测的优点是能够增加鉴定出呼吸道感染病原体的几率，并且在有合并感染时能够同时检测 1 种以上病原体。难点在于如何解读检测结果与患者临床状况的相关性。检测到一种病毒的微弱信号可能提示一种共生病毒或前次感染的结束，但也可能表明感染为近期发生，并且在逐步发展。
另一种可能是较弱的信号提示明显的下呼吸道病毒感染，但病毒尚未在上呼吸道很好表达，而此时上呼吸道存在另一种病毒感染。关于哪一种临床样本具有最高诊断价值的问题也取决于病毒的致病机制。
多重检测的快速发展可能超出了临床对其的需求，它不仅没有为临床医生提供有用的信息，而且使得临床解读和决策制定变得更为复杂。一项在新生儿 ICU 中开展的前瞻性研究显示了对多重 PCR 病毒检测结果的解读有多么困难。在 1 年中，虽然一些疾病与呼吸道病毒感染相关，但在无临床疾病的情况下也常常能检测出感染。
五、细菌性呼吸道感染的诊断试验
尽管技术在进步，但细菌性呼吸道感染诊断的金标准仍然是传统培养，然后采用各种手动或自动方法进行菌种鉴定和药物敏感性检测。个别实验室可能在一些检测步骤中使用分子方法（内部或外部开发的）。这一补充方法常用于培养困难或耗时的病原体，如百日咳杆菌、嗜肺军团菌、肺炎支原体和肺炎衣原体。
然而，培养和药物敏感性试验的标准操作通常需要花费 2-3 天，培养至少 1 天，药物敏感性试验还需要 1 天。与此同时，许多患者接受了经验性抗生素治疗。这种治疗往往是无效的、不适当的或两者兼而有之。抗生素无效常常是由于其治疗的是由耐药菌所致的感染或者非细菌所致的感染。在重度感染或免疫功能低下患者中，这种无效治疗可导致发病率和死亡率增加。
因此，临床医生常凭经验使用终极的广谱抗生素如碳青霉烯类治疗敏感菌所致的感染，使患者可能发生不必要的不良反应，并促使抗生素耐药的发生和传播。由此可见，亟需快速床旁检测和患者近旁检测技术以提高诊断的速度和准确性，从而为临床医生选择合适的抗感染治疗提供信息。
1. 现有的细菌诊断技术
呼吸道感染特定细菌病原体的实验室诊断非常困难。作为金标准的培养方法不能识别病原体的几率达 30%，原因可能是存在未知的病原体以及准确性和敏感性低。基于核酸检测的快速分子诊断方法使这一问题得以解决。由于抗生素耐药决定簇众多以及多重 PCR 检测技术存在局限性，因此采用上述技术对抗生素耐药进行准确而全面的检测困难重重。
2. 检测下呼吸道细菌感染的新试验
尽管该领域已取得了显著进展，但市场上销售的平台或试验极少，而且有关这些试验临床评估的研究很少发表（表 3）。 表3.jpg
现有的唯一一款综合性产品是 Curetis 的 Unyvero P50 肺炎诊断试剂盒，可以同时检测呼吸道样本中的 17 种细菌和真菌病原体及 22 种抗生素耐药标记物，完成该检测约需 4 小时。试剂盒的组成很普通，包括与社区获得性肺炎（肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和非典型细菌）和医院获得性肺炎（金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单孢菌）相关的细菌，以及这些细菌的一些耐药决定簇。
检测的耐药决定簇包括编码β内酰胺类耐药（mecA、blaCTX-M、blaDHA、blaEBC、blaOXA-51 和 blaKPC）、大环内酯类耐药（ermB 和 mefA）、氟喹诺酮类耐药突变（gyrA83、gyrA87 和 parC）和 I 类整合子（int1 和 sul1）的基因。
尚缺乏对该试剂盒独立的实验室和临床评估数据，但制造商赞助的研究显示敏感性和特异性有差异。虽然总体检测的敏感性和特异性分别为 80.9% 和 99.0%，但敏感性的变化范围较大（50%-100%），特异性亦如此（72.3%-100%）。
目前还没有获批的 GeneXpert 试验用于细菌性下呼吸道感染，但一项研究报道使用该平台可以检测出呼吸道样本中的金黄色葡萄球菌。该研究检测了 135 份从疑似通气相关肺炎患者获得的气道内吸出物（通过镜检显示存在革兰阳性球菌），并将结果与传统定性和定量培养获得的结果进行比较。虽然研究者报道与定性培养相比特异性更高（89.7%），但镜检较定量培养差（72.2%）。
大多数实验室报告定量结果，并且将 104-105 集落形成单位 /mL 作为有意义感染的标准，低于此标准可能为定植和污染。一篇 Cochrane 综述发现，在通气相关肺炎的诊断中比较以定量培养和定性培养为基础的方法，结果无差异。
六、检测上呼吸道感染的试验
其他主要检测上呼吸道感染的试验包括 Biomerieux Biofire 的 Filmarray 呼吸道诊断试剂盒。该系统整合了样本制备、扩增和检测，出结果约 1 小时，需要手动操作的时间很少，因而适用于床旁。它利用上呼吸道样本（鼻咽拭子）可以检测多达 20 种病毒和细菌病原体。其中，细菌局限于百日咳杆菌、肺炎支原体和肺炎衣原体。到目前为止，有关性能和检测的详细数据很少（表 3）。
七、以测序为基础的呼吸道感染诊断试验的开发
传统的全基因组测序（WGS）需要有病原体的知识，而新一代测序（NGS）方法可以测定一份样本中所有的基因物质。NGS 能够测定许多微生物的基因组，并且几乎实时地输出和解读测序结果。由此可见，NGS 提供了一种无偏倚的方法，用于检测临床样本中任何病原体、抗生素耐药基因以及发现新的病原体。
NGS 方法敏感且具有多重检测的能力，并且赋予微生物学实验室很多优势，使其能够快速检测耐药，并及时发现院内细菌和病毒病原体的传播。因此，传统方法很难检测出低水平耐药突变，其导致了抗生素和抗病毒药物的表型耐药。由于需要扩增子，从而限制了测序的长度，以及 Sanger 方法在感染暴发中用于病原体基因分型的价值。
1. 利用痰标本的 NGS 用于呼吸道感染诊断
采用 NGS 方法可以测定一份样本中的多个不同病原体或在一次反应中检测多份样本。条形码技术即对每一份样本标上特定的识别码，可用于同时测定来自相同病原体感染患者的多份样本。在 NGS 广泛应用前还需要做一些改进，例如提高病原体测序的敏感性和开发实际使用中易于操作的软件。有必要开发无需预先培养或 PCR 扩增来增加目标病原体数量的方法。
一个欧洲资助的集团 PATHSEEK 正在研究具有高多重性的多重试验和一次反应检测多种不同病原体的多重试验，采用 NGS 方法结合定制的软件进行病原体（包括流感和结核）的全基因组测序。其他方法保留了 NGS 无偏倚的特性，并代以非选择性的 RNA 转录物（分离自临床标本）深度测序，由此捕获 RNA 和 DNA 病原体，并发现新的病原体。
纳米技术如纳米孔测序和移动设备的出现有望加快检测时间、减少占用空间和降低成本，从而使我们能够在不久的将来实现患者近旁病原体基因组测序和数据解读。
2. NGS 用于检测抗生素耐药
相较于 Sanger 方法，NGS 每次反应能够产生更多测序数据，并且能够同时检测多种耐药突变，即便这些突变发生在非相邻基因。NGS 方法在一次反应中能够检测更长的区域，包括病原体全基因组，这对于识别病原体传播途径和监测感染暴发的表型分析非常有用。虽然目前已有多种不同的 NGS 方法，但对大多数病原体而言，其原理是相同的，即对扩增的 DNA 模板分子进行无偏倚测序。
更高级的新一代方法包括 PacBio 和 Nanopore（纳米孔），能够通过单分子测序提供成千上万碱基的读长和总体误差率较高的通量。利用 NGS 方法可以对一份样本中多种不同病原体或在一次反应中对多份样本进行测序。
检测抗生素耐药特别是复杂的多药耐药病原体的难点在于快速收集和分析所产生的数据。这就需要建立强大的数据库和数据分析法则，从而快速将基因组与可能的抗生素耐药谱相联系。
八、开发新型病毒性呼吸道感染的诊断试验
MERS 是一种新出现的人类疾病，主要累及呼吸道。沙特阿拉伯于 2012 年 9 月首次报道，从吉达的一名死于重症呼吸道疾病的患者中发现了 MERS-CoV（一种新型β冠状病毒）。此后，多项社区和医院研究明确了该病毒的流行病学、传播方式和轻到重度临床表现，包括急性暴发性疾病与合并的内科疾病的相关性。
在第一例 MERS-CoV 感染病例报道后不久，迅速开发了一种用于 MERS-CoV 检测的 rtPCR 分子诊断试验，并获得了 WHO 的批准，目前正在开发床旁检测。
多项研究关注了血清学试验的开发和评估（表 4），旨在筛查人类和潜在的动物储存宿主。这些试验包括采用表达 MERS-CoV 重组 N 或 S 蛋白猴肾细胞的免疫荧光法、采用病毒感染细胞的传统免疫荧光法，以及利用表达重组 N 或 S 蛋白 2 细胞的裂解物进行的免疫印迹分析。
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已开发了一种无细胞的蛋白微阵列技术，利用 MERS-CoV S 蛋白正确折叠和糖基化的 S1 片段作为抗原。MERS-CoV 和 MERS-CoV-S 蛋白假病毒被用于中和反应。从埃及和香港健康献血者获得 1343 份血清样本，比较常规病毒中和试验和 S 假病毒中和试验，对照组为两种中和试验均阴性。亟需在受累国家中开展大规模血清学和病例对照研究以进一步明确 MERS-CoV 的范围、患病率和传播方式。
WGS 对研究病毒传播和演变很有用。多项基于核酸检测的研究在非洲、沙特阿拉伯和北美的不同种类蝙蝠中发现了密切相关的冠状病毒。在家禽中进行 PCR 和和血清学方法的比较显示，独峰驼携带 MERS-CoV 中和抗体，而针对人类 MERS 病例（经 rtPCR 确诊）所在农场骆驼的研究进一步证实了上述发现。
一篇报道称，从一名死于实验室确诊的 MERS 患者获得的 MERS-CoV 序列与从患者接触过的有流涕症状的独峰驼获得的相同。
九、开发肺结核的快速诊断试验
全球 880 万肺结核病例中估计有 300 万因未被诊断而仍未接受治疗，导致疾病的进一步传播。2012 年，全球约 45 万多药耐药结核病例中有 80% 未被诊断。肺结核患者主要表现为呼吸道症状，在进行结核筛查前接受过多个疗程的抗生素治疗。
鉴于具有百年历史的痰镜检仍在持续使用、传统的以培养为基础的结核诊断非常耗时、以及结核的全球发病率和相关死亡率较高，促使全球致力于开发新的快速且更敏感的结核诊断方法（表 5）。
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过去 5 年中，该领域得到了空前的发展，众多中小型企业开发了以培养、分子和非分子方法为基础的新型诊断试验。一个主要的担忧是并非所有上市的试验都接受过严格的评估，包括诊断准确性、在实际使用中的稳健性、成本效益和实用价值。
新的床旁、患者近旁结核诊断有多个目标：采用 Xpert MTB/RIF 方法快速诊断结核和识别利福平耐药、采用 Hain 公司的 Genotype 多药耐药 Plus 系统识别多药耐药结核，以及采用数目可变串联重复序列 - 结核分枝杆菌散在分布重复单元（VNTR-MIRU）基因分型法进行接触病例跟踪的优先排序。
Xpert MTB/RIF 方法使用 Cepheid 公司的 GeneXpert 系统，是快速床旁分子诊断的雏形。痰分析结果可在 2 小时内获得。多项在不同医疗场所进行评估的研究显示该方法敏感且特异，对涂片阴性的肺结核患者检出率增加（表 4）。然而，这项诊断革新并不总能获得更好的临床预后。
在一项评估 Xpert MTB/RIF 方法对临床预后影响的随机多中心研究中，虽然大部分患者在就诊当天开始治疗，但在降低结核相关死亡率方面没有显著改善；研究者认为，无获益的原因是对照组接受了有效的经验性治疗。其他有希望的试验平台正被引入结核诊断中，其具有更好的床旁功能、更高的检测准确度，并且能够开发出更多的耐药靶标。
虽然以结核为中心的开发诊断试验很重要，但必须认识到这不符合更长远的目标，即为非传染性和其他传染性疾病提供最佳的集中医疗保健。
尽管对结核分枝杆菌的耐药株有可能进行基因分型分析，但实验室方法仍存局限，如更快、更准确地鉴定抗生素耐药表型。痰标本的直接测序需要预先通过培养或其他富集方法进行病原体富集。以微阵列为基础的多重测序和以核酸为基础的深度测序用于同时检测结核分枝杆菌 DNA 和对多种一线或二线抗结核药的多药耐药，这些方法有望为快速床旁结核诊断带来一次革命。
新一代台式测序系统有可能实现对痰标本直接进行结核分枝杆菌测序以明确其对所有一线和二线抗结核药物的耐药性，并且能够解决痰标本中细菌载量较低的问题，与培养为基础的耐药检测相比，检测周期快数周。另外还需要绘制全面的抗生素耐药突变图，并开发出易于解读耐药分析结果的软件。
WGS 方法与细菌定量相结合可以获得所有多药耐药结核分枝杆菌分离株之间的基因型 - 表型相关性，并且有可能提取出有利用价值的基因组数据，用于开发床旁诊断试验和耐药筛查试验，以及用于流行病学和公共卫生管理。
十、未来的需求和挑战
多家制造商正在开发有潜在价值的诊断技术，并着手将其推向市场。有必要提高对个别微生物在呼吸道疾病中的作用以及病原体数量与疾病真实关系的认识。实现分子检测的一项重要挑战是试验能否鉴别微生物是定植、感染，还是病因。标准的实验室培养通常包括定量标准，常规界值为 105CFU/mL。
呼吸道标本不可避免地会受到鼻咽部定植微生物的污染，而敏感性提高的分子方法可以检测出这些定植微生物。而且，一份标本中可以存在多种病原体。这些病原体是代表了真正的合并感染还是感染与定植混合需要进一步确定。感染和定植的鉴别困难使临床医生处于两难的境地，究竟是否要用这些结果来指导治疗。在诊断试验中纳入定量方法如使用定量 PCR 可能可以改善数据的解读。
目前，最大的技术缺口在于下呼吸道感染的诊断，由欧盟资助的合作联盟和创新药物计划如 PATHSEEK、呼吸道感染快速鉴定（RiD-RTI）和感染性疾病快速床旁诊断平台开发项目（RAPP-ID）正致力于该领域。
RiD-RTI 的目标是开发一种快速的样本进、数据出的以核酸为基础的试验平台，用于由病毒和细菌病原体所致的所有类型肺炎（社区获得性肺炎、医院获得性肺炎和通气相关肺炎）的诊断，而 RAPP-ID 旨在利用各种技术开发流感、通气相关肺炎和社区获得性肺炎的床旁诊断试验。越来越多的用于呼吸道感染诊断的高质量床旁检测产品有望在未来 5 年内上市。
随着 NAAT 技术的进一步发展，可能实现多种目标病毒和细菌的联合分析。全自动化的多重 NAAT 检测如 GeneXpert、Nanosphere（纳米球）和 FilmArray 仅适用于低通量的情况；但对于纳米球技术，通过加入多达 16 种处理模块，可能可以适度增加通量。经验证的 NAAT 检测的成批处理用于诊断一些病原体常与更传统的微生物学方法相结合。
未来，可能需要分 3 个阶段来开发具有成本效益的呼吸道感染快速诊断。第一阶段是一种低通量、全自动化的 NAAT 平台，作为初级医疗或二级医疗急诊部的床旁检测，由临床医护人员完成，可以为患者入院和感染控制提供诊断信息。
第二阶段是一种稳健的内部或大批量生产的商业化 NAAT 检测，旨在提高实验室的诊断能力，使其能够应对二级医疗机构中遇到的各种目标呼吸道感染。
第三阶段尚未完全建立，是一种病原体发现方法，首先对临床样本中的多聚腺苷酸 RNA 进行非靶向性扩增，然后基于阵列筛选出可能的病原体。对任何捕获结构进行测序可能需要耗费更长时间，但当前 2 个阶段都未获得结果时，该方法为得出诊断提供了最后一次机会。这种三阶段式的诊断流程获得有意义诊断信息的概率最大。
第一阶段的全自动化 NAAT 平台处于商业化的早期，如能证实成功，它们将有可能迅速被全球的医疗保健系统所采纳。然而，第三阶段，即所谓的病原体发现方法，尚未被开发用于临床，可能需要过一些时间才能实现所提出的目标。
自动化的使用和可靠性的改善促使诊断试验移至实验室以外进行，并且向临床医生为患者提供医疗服务的地点靠近，理想情况下，还能利用太阳能在发展中国家的农村进行检测。
十一、结论
多项技术进步带来巨大希望，虽然在病原体特异性快速诊断的开发领域取得了显著进展，但有关数据解读、敏感性和特异性方面的问题仍有待解决。围绕着高敏感性和特异性 NAAT 使用的临床困境是从一份呼吸道标本中鉴定出的病原体核酸可能并非来自致病病原体。
从临床处理角度来说，对于就诊于任何医疗场所的呼吸道感染患者，需要一种快速诊断试验，该试验可以从一份呼吸道样本中鉴别细菌和病毒感染，鉴定细菌的种类，并且描述抗生素敏感性。该试验能够促使针对病原体的治疗迅速启动或经验性抗生素治疗的迅速调整，由此改善呼吸道感染患者的治疗和预后。对于任何将被推广的新试验，应能利用太阳能，并且所使用的反应物不需要低温运输储存。
重要信息
1、全球有数百万的成人和儿童持续死于由多种病原体所致的可治愈性呼吸道感染。
2、抗生素耐药细菌和具有流行潜能的新型呼吸道病毒的出现成为了全球关注的焦点。
3、只有通过快速、准确地诊断呼吸道感染的致病微生物并启动合适的抗生素治疗，才能获得最佳的临床治疗效果。
4、目前已能够利用呼吸道标本中的微生物核酸对菌种和特定的耐药基因靶标进行扩增。
5、分子诊断平台促使快速诊断试验能够利用核酸扩增技术（NAAT）在自动化平台上实现。围绕着高敏感性和特异性 NAAT 使用的临床困境是从一份呼吸道标本中鉴定出的病原体核酸可能并非来自致病病原体。
6、很少有经验证的 NAAT 试验（筛查由特定病毒或细菌所致的呼吸道感染）被诊断实验室所采纳用于诊断部分病原体，通常与更传统的方法相结合。
7、大多数发展中国家的实验室使用古老的传统方法诊断呼吸道感染，除外 Cepheid 公司的 GeneXpert MTB/RIF 检测法，该方法正在全球广泛推广，用于结核和利福平耐药的快速诊断。
8、以微阵列为基础的多重测序和以核酸为基础的深度测序用于同时检测病原体核酸和多种抗生素耐药，这些方法有望为快速床旁结核诊断带来一次革命，并且在识别新的细菌和病毒病原体方面已经显示出巨大价值。
9、虽然该领域已取得了进展，但仍亟需具有病原体特异性、敏感性且费用不高的快速床旁诊断试验，从而改善临床治疗、感染控制和公共卫生部门应对新出现病原体的能力。
转自：http://infect.dxy.cn/article/95430
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