wwwkkk83 发表于 2017-3-13 10:10:05

嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结

嘌呤霉素杀灭曲线的确定(shRNA稳定转染细胞株,仅作参考)
(1)24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板,铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。细胞孵育过夜;

(2)准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基(如0-15μg/mL,至少5个梯度);
(3)细胞孵育过夜后加入筛选培养基,孵育细胞;
(4)约2-3天更换新鲜的筛选培养基;
(5)每日监测细胞观察存活细胞比例。嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。
(6)最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。

   嘌呤霉素筛选稳定转染细胞
(1)day 0:24孔板内以5~8 x 104 cells/
孔的密度铺板,孵育过夜;(2)制备筛选培养基:含有最佳筛选浓度嘌呤霉素(由杀灭曲线确定)的新鲜培养基;(3)day 1:筛选第一天,去除旧的培养基,加入一定量MOI的病毒颗粒;(加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。)(4)病毒转导后约6-8h,再添加1ml完全培养基(血清和双抗,如果已经使用双抗。)到细胞内,然后孵育过夜;(5)病毒转导后48h,使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。孵育。 (6)约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基;(7)每天检测细胞并观察活细胞生长比例,以及turboGFP表达的水平及所占比例。在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。
注:病毒的MOI越高,每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。在做嘌呤霉素筛选时,需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞,但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。

   储存方法和稳定性:   嘌呤霉素稳定性高,可以常温运输,收到产品后4℃存放;嘌呤霉素在室温条件下可存放3个月,4℃条件下保质期一年。为了达到最理想的稳定状态和最长的保质期,最好存放于-20°C,保质期为2年。

  部分常见哺乳动物细胞的推荐工作浓度表
细胞名称细胞类型嘌呤霉素浓度
A549Lung cancer1-2μg/ml
B16Mouse melanocytes1-2μg/ml
ES cellHuman embryonic stem cells0.5-5μg/ml
H1299Non-small cell lung carcinoma1-3μg/ml
HEK293Human embryonic kidney0.5-3μg/ml
HeLaHuman cervical cancer1-2μg/ml
HepG2Human hepatocellular carcinoma0.5-2μg/ml
HT1080Human fibrosarcoma0.5-2μg/ml
MCF-7Human breast cancer0.5-2μg/ml
MDA-MB-231Human breast cancer0.5-5μg/ml
MEFMouse fibroblasts1-5μg/ml


wwwkkk83 发表于 2017-3-13 10:33:41

   Puromycin是来源于Streptomyces alboniger的一种氨基核苷类抗生素,中文名为嘌呤霉素,常用于筛选通过质粒转染/转
化、病毒感染等方法能表达pac基因(puror)的真核或原核多克隆或单克隆细胞。Puromycin不仅用于稳定细胞株的筛选,也用于稳定细胞株的维持。本产品的10mg/ml包装经过滤除菌,可以直接用于细胞培养。
      Puromycin的特点是快速作用于细胞,一般2天内可以杀死99%的不表达pac基因的细胞。
      在革兰氏阳性菌、动物或昆虫细胞中,嘌呤霉素通过抑制蛋白质合成而抑制或杀死细胞。其作用机制为嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3'末端的类似物,能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中。嘌呤霉素与A位点结合后,不会参与随后的任何反应,从而导致蛋白质合成的提前终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。
      Pac基因表达嘌呤霉素N-乙酰转移酶(Puromycin N-acetyl-tranferase),该基因是在Streptomyces alboniger中发现的。如果表达基因,就会对嘌呤霉素产生抗性,这一特性目前普遍应用于筛选表达pac基因的哺乳动物稳定细胞株等。例如,很多商业化的慢病毒载体都携带pac基因(一般在质粒图谱上标记为puror),从而利用嘌呤霉素筛选特定基因的稳定表达细胞株。嘌呤霉素也可以用来筛选表达pac基因的大肠杆菌菌株、酵母菌株等。
   本产品10mg/ml包装配制在20mM HEPES(pH7.4)溶液中,浓度为10mg/ml,经0.22μm滤膜过滤除菌,可以直接用于细胞培养。本产品250mg包装为粉末装。




保存条件:
      -20℃保存,至少一年有效。10mg/ml包装避免反复冻融。
注意事项:
       本产品可能对人体有一定的毒害作用,请注意适当防护,以避免直接接触人体或吸入体内。
       本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
       为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

wwwkkk83 发表于 2017-3-13 11:23:12

哺乳动物稳定表达细胞株的筛选
转染含有pac基因的质粒或者感染含有该基因的病毒后,即可筛选稳定表达株。
a. 细胞转染或感染48小时后,将细胞置于含有适当浓度嘌呤霉素的新鲜培养基中培养,此为处理组。
注意:当细胞处于分裂活跃期时,抗生素作用最明显。细胞过于密集,抗生素产生的效力会明显下降,所以细胞的密度最好不超过25%。建议同时做一个正常细胞的对照组。转染或感染48小时后,如果细胞过密也可以消化后重新接种细胞,培养过夜后即可进行嘌呤霉素筛选。
b. 每隔2-3天,更换含有嘌呤霉素的培养基。
c. 筛选7天后,对照组正常细胞应该100%死亡,处理组中存活的细胞为表达pac基因的细胞。然后根据实验目的进行多克隆或单克隆细胞的筛选。
注意:每日进行细胞生长状态的观察。嘌呤霉素的筛选至少需要24小时,有效浓度嘌呤霉素的筛选周期一般在2-10天。
d. 待细胞可以稳定生长后,嘌呤霉素的浓度可以减半用于后续的培养。在得到稳定表达细胞株后,一般建议嘌呤霉素也须持续加入,并2-3天更换含有嘌呤霉素的新鲜培养液。

wwwkkk83 发表于 2017-3-13 11:39:57

Suggested Puromycin Concentration
Cell LineConcentration [µg/ml]Reference
HT1080 (human fibrosarcoma)0.2–0.4
1
2J Biol Chem282:29314–29322 (2007)
J Virol82:3320–3328 (2008)
Cancer Res68: 1417–1426 (2008)
HeLa (human cervical cancer)1-2
2
2Genes Cells12:397–406 (2007)
Mol Cell Biol28:4104–4115 (2008)
PNAS105:16490–16495 (2008)
HEK293 (human embryonic kidney)0.25
2
3Nucleic Acids Res36:e83 (2008)
Mol Cell Biol28:4104–4115 (2008)
Mol Cell Biol 27:4708–4719 (2007)
Hep G2 (human hepatocellular carcinoma)0.3
2
2J Biol Chem283:21462–21468 (2008)
Mol Cell Biol28:4104–4115 (2008)
J Biol Chem283:708–715 (2008)
Human embryonic stem (ES) cells0.5
1
5Nucleic Acids Res 36:e148 (2008)
Stem Cells26:850–863 (2008)
Stem Cells26:2245–2256 (2008)
MCF-7 (human breast cancer)0.45
1
2RNA13:1375-1383 (2007)
Cancer Res68:1319–1328 (2008)
Mol Cell Biol28:4104–4115 (2008)
H1299 (non-small cell lung carcinoma)1
1.5
2.5Nucleic Acids Res 35:e17 (2007)
J Biol Chem283:33394–33405 (2008)
Proc Natl Acad Sci USA 105:1937–1942 (2008)
MDA-MB-231 (human breast cancer)0.5
1.5
5Mol Cell Biol28:997–1006 (2008)
Mol Cell Biol 27:324 – 339 (2007)
Mol Cell Biol 28:687–704 (2008)
A549 (lung cancer)1.5
1.5Mol Cell Biol 27:324–339 (2007)
J Biol Chem283:33394–33405 (2008)
不同文献中某些细胞的作用浓度  仅供参考
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