病毒病的分子生物学诊断
转自：http://www.docin.com/p-412854877.html 近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，尤其是分子遗传学的进步，大大提高了病毒病的诊断水平。病毒病的实验室诊断技术已从常规的病毒分离鉴定以及抗原和抗体的免疫学检测，进入到可对病毒基因序列和结构直接进行测定的分子生物学水平。病毒病的分子生物学诊断，包括对病毒核酸(DNA或RNA)和蛋白质等的测定，关键在于测定这些分子的特异序列或结构。病毒基因组往往含有特异序列，可以用核酸杂交的方法予以检出，而这段序列的存在则说明了该病毒的存在。虽然病毒是严格细胞内寄生的最小、最简单的生命形式，但也具有与宿主细胞不同的独特的核酸序列和基因结构。常用的分子生物学诊断技术包括基因组电泳分析、DNA酶切图谱分析、寡核苷酸指纹图、核酸杂交、聚合酶链式反应(PCR)等。其中核酸杂交和PCR技术又以其特异、快速、敏感、适于早期和大量样品的检测等优点，成为当今病毒病诊断中最具应用价值的方法。DNA杂交的灵敏度已经提高到0.05pg/μl水平，也就是说，只要有1 000个DNA拷贝，就可能被检测出来。使用PCR甚至可以检测出一个拷贝的DNA分子。分子生物学诊断的特异性取决于核酸序列的特异性。现已发现某些病毒与宿主细胞或与其它病毒之间存在着同源的核酸序列，因此在建立分子杂交或PCR诊断方法时，需要了解基因片段的核苷酸序列，获得病毒特异的片段。在这一片段上标记放射性同位素或非放射性物质(如地高辛、生物素等)作为探针,就可建立分子杂交诊断方法;也可根据这一片段的核苷酸序列，设计一对特异引物，应用PCR技术扩增这一片段。获得病毒特异DNA片段的基础是进行病毒基因的克隆，即首先建立易于获得足够量病毒DNA的病毒基因无性繁殖系。病毒基因克隆以后，就可以比较容易地用酶促法或化学法来测定其核苷酸序列，再将获得的序列输入计算机，与基因序列库中的己知序列进行比较分析，就能准确地定位病毒特异的基因序列。到目前为止，越来越多的病毒基因被克隆和测序，几乎涉及所有动物病毒科的成员，一些重要病毒的全基因序列已被测定，这无疑促进了病毒病分子生物学诊断技术的发展。
七、病毒核酸序列的测定
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)能够清晰地分辨仅差别1个碱基的单链寡聚核苷酸。核酸序列测定技术就是在这种高分辨率变性PAGE技术的基础上建立起来的。
目前有二种DNA测序方法:酶促法和化学降解法。虽然其原理大相径庭,但它们都需要使待测DNA片段转变成一系列标记的单链寡聚核苷酸,这一系列寡聚核苷酸均有一个固定的5’末端(起始端),但3’末端(终止端)长度不同，形成一系列只相差1个核苷酸碱基的连续末端。它们是通过分别终止于DNA链上不同位置的A、T、C和G碱基这4种反应体系来制备的。这4种反应生成的单链寡聚核苷酸。在变性PAGE中上样于相邻的加样孔，电泳后就可以读出被测DNA链的碱基组成顺序了。
下面主要介绍酶促测序法，也就是常用的双脱氧末端终止法。其原理类似于DNA聚合酶合成和延伸DNA链的过程，只要在新的DNA链合成过程中，加入一种特殊的底物双脱氧核糖核苷酸(ddNTP)，它的5’端能正常连接到上一个核苷酸的3’端，形成磷酸二酯链，但它的3’端羟基因脱氧而不存在，所以不能与下一个核苷酸的5’端形成磷酸二酯键连接。当正常DNA合成过程中，掺入这种ddNTP，新DNA链的延伸也就终止于此。因而在4种反应体系中，分别加入4种不同的双脱氧核苷酸，即ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP。由于ddNTP是随机掺入的，于是4种反应体系中，新DNA链的延伸可随机终止于任何位置的A，T、G或C碱基，最后得到一系列仅差一个碱基的单链寡聚核苷酸。
二、病毒基因的克隆与鉴定
病毒基因的克隆是在原核细胞中进行的。可以采用细菌质粒、粘性质粒或λ噬菌体作为载体，但最常应用细菌质粒载体，在大肠杆菌(E.coli)中进行。用于基因克隆的质粒必须具备3个主要结构特征：1.具有负责其在宿主细胞中自主复制的复制起始区(Ori)；2.具有克隆后便于筛选的标记基因(如对各种抗生素的抗性基因等)；3.含有外源基因的克隆位点。常用的质粒有pUC18/pUC19和pBR322等。pUC18/pUC19为高拷贝质粒(120～200个／细胞)，含有多克隆位点，以可满足多种内切酶切割的DNA片段的克隆；pBR322为中拷贝质粒(50～80个／细胞)。
病毒基因克隆的目的在于：1.病毒基因片段的大量制备；2.序列分析；3.基因表达与调控研究；4.构建病毒载体；5.制备核酸探针等。病毒的基因组有DNA和RNA以及双链和单链之分。在着手进行基因克隆前，了解目的病毒的核酸类型是必要的。对不同类型的病毒，采用不同的基因克隆方法:DNA病毒可在限制性内切酶切割后直接进行克隆；RNA病毒则必须先在试管内反转录成cDNA后再行克隆；反转录病毒可从感染细胞中提取前病毒DNA，随后再行克隆。总的来说，病毒基因的克隆包括以下几种类型：
单链DNA病毒的基因克隆主要指细小病毒科成员。这类病毒的基因组为单链线状DNA,两端因回文序列而形成发夹结构，这一结构是病毒基因组复制的引物，因此在感染过程中，病毒基因组可在宿主细胞内形成双链DNA形式的中间复制型DNA。提取这种复制型DNA，用单链核酸酶去除两端的发夹结构，就可对该病毒全基因组进行克隆;也可用适当的内切酶切割后，回收所需的片段进行克隆。
双链DNA病毒的基因克隆绝大多数的动物致病性DNA病毒含有双链DNA基因组,但是它们之间的差别较大。对于较小的双链DNA病毒，如SV40、乙型肝炎病毒等，它们的基因组为环状双链DNA。在克隆时，使用对这些环状DNA只有单一切点的内切酶切割，然后与适当的载体连接，就可以建立全病毒基因组的无性繁殖系。
对于较大的双链DNA病毒，如痘病毒科和疱疹病毒科的成员，克隆它们的全基因组十分困难。必须用适当的内切酶将基因组切成较小的片段，然后再建立各片段的无性繁殖系，即建立基因组文库。或者根据研究目的，回收其中的目的片段进行目的克隆。但是，这类病毒DNA均为线状双链，在克隆二个末端片段时，必须对两端的基因片段的末端进行修饰，如补平或加接头，然后再行连接克隆。
RNA病毒的基因克隆对分节段的RNA病毒，如流感病毒、呼肠孤病毒和轮状病毒等基因组，可以先分离特定的RNA片段，反转录cDNA后，与适当的载体质粒，加G/C尾或A/T尾进行连接。对不分节段的RNA病毒基因组，也要分段反转录成cDNA后，进行克隆。
病毒基因组中某一特定基因片段的克隆如果已经了解这一病毒基因组的酶切图谱，则可选用适当的限制性内切酶切割病毒基因组，回收特定片段，重组到适当的质粒载体，进行克隆；如果知道需要克隆的基因片段的序列，便可设计并化学合成一对特异引物，用PCR法扩增这一片段，然后重组到适当的质粒载体进行克隆。
虽然由于病毒种类和实验目的的不同，基因克隆的方法也不尽相同，但任何一种病毒基因克隆方法均有3个主要步骤：1.病毒基因组的提取；2.与质粒载体的连接重组；3.重组质粒的筛选、鉴定。
病毒基因组的提取 这是基因克隆的一个重要环节。其基本原则是：先从感染组织或细胞,以及含病毒排泄物和分泌物中提取病毒粒子，然后去除病毒蛋白，提取病毒核酸。在提取过程中，要注意避免核酸酶对病毒核酸的降解作用。特别是在提取RNA时，所用的试剂和用品均需要事先进行无RNase处理或高压灭菌。此外在提取较大分子量的病毒DNA时(如痘病毒DNA)，要彻底去除病毒蛋白(通常使用蛋白酶K)和避免剧烈振荡(否则核酸链断裂)。
三、病毒基因探针的制备
选择病毒基因序列作为探针时,首先要考虑所选定的探针是否具有高度特异性,换句话说,作为探针的核酸片段必须含有病毒独特的核酸序列;其次应考虑探针来源是否方便,探针通常来源于重组质粒中已克隆的病毒DNA片段,这样易于大量制备。一般来说,探针的大小在1～3Kb左右,如小于0.5Kb,可能难以大量制备,而且标记率不高;反之,片段过大(大于3Kb),则容易出现非特异杂交。
(一)病毒基因探针的种类
根椐来源及性质，病毒基因探针可分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和化学合成的寡聚核苷酸探针等几类。试验者可根据需要和实验条件来选择使用这些探针。
1.基因组DNA探针
对于双链DNA病毒，可用限制性内切酶切割其基因组DNA，克隆其中一个片段作为探针材料。这一片段应该最具有该病毒的特点，代表该病毒最特异的基因序列。应用这种特异探针所取得的杂交结果是最真实可靠的。
对于单链DNA病毒，其基因组DNA不能被限制性内切酶切割，所以难以克隆特异片段。制备这类病毒的探针时，一般首先使用DNA聚合酶，制备其双链DNA，或者提取感染细胞中的复制型双链DNA，用适当内切酶切割后，克隆特异片段制备探针。
2.cDNA探针
制备单链或双链RNA病毒的探针时，一般先对病毒RNA进行反转录,合成该病毒的cDNA，然后克隆特异cDNA片段作为探针材料。
3.RNA探针
应用RNA探针进行分子杂交是较为理想的。因为：①RNA／RNA或RNA／DNA杂交体比 DNA／DNA杂交体更稳定，杂交反应可在更严格的条件下进行，因而杂交的特异性更高，结果更可靠；②RNA探针为单链，不存在互补双链的竞争结合，其与待测核酸的杂交效率更高；③杂交后，可用RNase将未杂交的探针RNA消化掉，从而使本底降低。RNA探针大多是通过基因组DNA或cDNA克隆经体外转录而获得的。
4.寡聚核苷酸探针
根椐病毒的特异序列,于DNA合成仪上化学合成一段单链寡聚核苷酸,即可作为探针使用。其优点是容易制备,可根椐需要随意合成任何序列,在合成时就可以加入带有标记物的某一种dNTP,因此片段合成后勿需另外标记,纯化后即可直接进行杂交。这类探针较短,长度一般不超过50nt,所以它所带的标记物相对较少,其灵敏度也较低。
(二)病毒基因探针的标记
因标记物的不同,基因探针的标记方法可分为放射性标记法和非放射性标记法。无论是DNA探针还是RNA探针,均可用这两种方法标记。根椐标记的部位,放射性标记可分为核酸片段内标记和末端标记。
四、核酸杂交检测技术
核酸杂交技术是分子生物学的基本技术之一,近年来正逐渐用于病毒病的特异、敏感和快速诊断。杂交的基本原理是碱基互补的二条单链核酸退火形成双链。用于诊断目的的杂交双方是已知序列的病毒探针和待测样品中的病毒核酸,杂交后通过特定方法检测。如有杂交信号,则说明样品中存在病毒核酸,进而证明病毒感染的存在。
待测的病毒核酸可以从病料中提取,也可以从纯化的病毒粒子提取。提取后可在膜上与探针杂交(固相杂交)。或直接在试管的杂交液中杂交(液相杂交),此外, 也可直接在组织切片或细胞涂片上对细胞中的病毒核酸进行杂交(原位杂交)。下面重点介绍如何建立杂交体系及适用于病毒诊断的几种杂交方法。
(一)建立杂交体系
核酸杂交是多种环境因素与二条互补核酸链综合作用的结果,它有较高的技术要求。了解各种组份及反应条件对杂交的影响是建立杂交体系,获得理想结果的基础。
1.温度
杂交反应中,双链核酸的变性与复性主要是温度控制的。选择适当的杂交和洗膜温度是实验成败最关键的因素之一。杂交反应通常在低于解链温度(Tm值)15～25℃的条件下进行。
Tm值受核酸链组成(G+C)、溶液的离子强度、pH值及反应体系是否含变性剂等的影响。在杂交体系不含变性剂的情况下,DNA之间的杂交反应通常在68℃进行,当含50%变性剂甲酰胺, 则在42℃进行。
2.pH值
杂交体系的pH在5～9的范围内对复性无明显影响。杂交反应通常在pH6.5～7.5之间进行。较高的pH值产生更严格的杂交条件。
3.盐离子浓度
体系中往往加入单价离子的盐,因为单价阳离子与核酸链上的磷酸基团发生静电反应,所以能降低核酸链之间的静电排斥,维持双链DNA的稳定性。盐浓度增加,稳定性提高。杂交体系中通常采用6倍SSC(1倍SSC为0.15 mol/L NaCl和0.015mol/L柠檬酸钠，pH7.0)缓冲液。
4.变性剂
杂交体系中加入变性剂可降低Tm值,所以杂交可在更低的温度下进行。常用变性剂是甲酰胺。
5.DNA浓度
浓度愈高,复性速度愈快。所以杂交反应中应加入足够的探针,还应尽量减少杂交体积,一般每百cm2滤膜用2.5ml杂交液。
6.探针长度
溶液中DNA复性率与片段长度的平方根成正比。所以用长的探针可获得高的复性率。但原位杂交通常用较短的探针,以减少探针进入细胞并扩散到靶核酸的阻力。
7.硫酸葡聚糖
在水溶液中,此化合物表面可吸附DNA探针分子,从而浓缩探针,促进二条核酸链间的缔合。其10%的浓度可提高杂交速度10～100倍。使用硫酸葡聚糖可能导致背景加深,所以一般在探针浓度过低的情况下才使用。
8.杂交时间
它受探针的长度与浓度、反应体积等因素的影响,较短的探针、较高的探针浓度和较小的杂交体积,需要较短的杂交时间。一般来说,杂交时间通常在2～16小时。
9.预杂交
在杂交前进行预杂交,封闭非特异的DNA结合位点,降低非特异杂交,是杂交的前提。常用的封阻试剂有非特异性的DNA(鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA)和大分子化合物(聚蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、脱脂奶粉等)。
10.碱基错配
杂交中碱基错配将明显提高杂交本底,从而影响杂交结果的判定。因此杂交可在更为严格的条件下进行,如低于Tm值15℃的温度下杂交。
11.漂洗
杂交后的漂洗是减少非特异杂交,降低本底的关键步骤。通常用较低盐浓度(0.1倍SSC)的缓冲液在较高温度下(如68℃)漂洗杂交膜。
(二)核酸打点杂交
核酸打点杂交是最常用的一种杂交检测方法,是作为诊断目的的首选方法。它是将一定量的病毒核酸(DNA或RNA)打点在固相支持膜(通常是硝酸纤维素膜或尼龙膜)上,然后与放射性或非放射性标记的(DNA或RNA)探针进行杂交,杂交后通过放射自显影(检测放射性探针)或显色反应(检测非放射性探针)检测杂交信号。阳性杂交信号表明病毒核酸的存在,检测出病毒核酸就充分说明发生了病毒感染。
(三)核酸酶保护分析法
该方法是近年来发展起来的一种新的RNA检测方法。它基于一种液相杂交方法,即被检测RNA链与均一分子的单链探针(放射性标记)在试管中进行杂交,然后用适当的单链核酸酶(S1核酸酶,RNA酶A和T1)水解掉未杂交的单链核酸,电泳分离后,通过放射自显影检测未被水解(被保护)的双链杂交体。
与Northern分析法相比,核酸酶保护分析法不需要固相支持膜,所以操作简便,杂交质量也不受RNA转移效率和洗膜条件的影响,而且信/噪比大大提高,其检测的灵敏度比前者提高10倍以上。此外,还能精确定量被检RNA。核酸酶保护分析法对RNA样品的纯度和完整性要求不高,样品可以用细胞总RNA,即使轻度降解,也不影响检测结果。采用的探针通常是单链的、但必须完全均一的DNA或RNA分子。单链DNA探针通常采用M13噬菌体系统,掺入同位素标记的一种dNTP来制备,或者采用末端标记来制备。RNA探针一般采用体外转录系统,掺入同位素标记的一种dNTP来制备(如前所述)。
1.RNA酶保护分析法(RNase protection assay, RPA)
本方法所采用的探针是单链RNA,它比DNA/RNA杂交体稳定得多。杂交后加入适量RNA酶A和T1,它们专一性地水解未形成杂交体的单链RNA,而探针与被检RNA杂交后形成的双链RNA则被保护,电泳分离后,通过放射自显影显示杂交信号。此方法甚为敏感,可以检测每个细胞中1～5个RNA拷贝。
2.核酸酶保护分析法
此方法类似于RPA,只是所用的探针是单链DNA(一般不用双链DNA探针);所用的酶是S1核酸酶,它能降解单链DNA或RNA,而RNA/DNA杂交体则被保护。
(四)核酸原位杂交
所谓原位杂交,就是保持组织与细胞形态的完整性,用核酸探针直接检测细胞内的靶核酸序列。它可以检测和精确定位胞浆内或细胞器上,胞核内或染色体上的各种靶核酸序列。该方法不需要从组织细胞中提取核酸,对细胞中含量极低的靶序列有较高的敏感性。
原位杂交是可以用于病毒感染检测的另一方法。它能检测细胞中病毒核酸的复制与表达以及病毒的传播,并对细胞中的病毒核酸进行定位;它能鉴定感染细胞中病毒基因的整合以及染色体上的整合位点。应用该方法,还能检测持续感染个体中何种组织含有病毒。除了必须对组织细胞进行固定,以保持原来的形态外,原位杂交与普通杂交方法没有大的区别。对组织细胞固定的好坏直接影响杂交的效果,所以用于核酸原位杂交的固定液必须:①理化性质稳定;②能很好保持细胞形态的完整;③对核酸无修饰和降解作用,并维持其在细胞内的定位;④不阻碍探针与靶核酸的杂交,不引起杂交本底过高。符合此条件的理想的固定液有10%甲醛、4%多聚甲醛、戊二醛和乙醇/冰乙酸(3∶1)等,其中4%多聚甲醛最为常用。
五、PCR扩增技术
PCR的全称是聚合酶链式反应(polymerase chain reaction),它是由Kary Mullis于1987年发明的。1976年人们发现了一种特殊的DNA聚合酶,它可以耐受94℃高温而不失活。1985年Saiki等人发现用聚合酶Klenow大片段催化25次DNA聚合反应(由于此酶不耐高温,所以每次反应需加入新的Klenow片段)可以将原有的DNA量特异地增大数百万倍。将上述两个实验合并在一起,用抗高温的DNA聚合酶(Taq或Vent)代替Klenow片段就形成了目前广泛应用的具有高度敏感性的DNA PCR扩增技术。
根据被扩增DNA片段的序列,人工合成两端各约15～30碱基的单链DNA引物。取极微量的模板DNA,加入Taq或Vent DNA聚合酶,A、C、G、T四种脱氧单核苷酸以及两端的DNA引物,置于PCR扩增仪上即可以进行DNA扩增。一次PCR循环,包括变性→退火→延伸三个过程,通常使用三个可调温度及时间:①DNA变性温度(一般为94℃)及时间,在此温度下模板DNA的双链分开;②退火温度及时间,这个温度可以根据DNA引物的长度和G+C含量计算出来,一般在42℃～62℃之间。退火处理后,DNA引物互补杂交到变性的DNA模板上;③聚合酶延伸反应温度多为72℃,反应时间随被扩增片段的长度而定,一般每合成1 000个碱基需要30～60秒和1单位Taq DNA聚合酶。如合成5kb片段,延伸反应时间应为5分钟,并使用5单位TaqDNA聚合酶(反应体积为100μl)。有时PCR使用双温循环,即92～94℃变性→68℃退火和延伸。理论上,每循环一次,模板DNA量扩大一倍,所以模板DNA的量是按2n指数幂进行扩增的,n代表PCR次数。如模板DNA数为1,PCR循环25次后,模板数将增至225,即33554432, 但在实际操作中,扩增效率往往低于理论值。这是因为DNA引物经多次循环后被消耗,在下一次循环时,没有足够浓度的引物与模板退火杂交。此外,多次高温处理后,Taq DNA聚合酶活性也会下降。即使这样,PCR也可在数小时之内对仅有的几个拷贝的基因放大数百万倍,使其在凝胶电泳后形成明显可见的DNA带。这是PCR技术正逐步用于临床病毒检测的最重要原因。
另一方面,很高的合成效率使得PCR容易出现非特异性扩增,所以要获得预想的结果,必须选好欲扩增片段在基因组上的位置,设计特异的引物序列,优化PCR反应的各种条件和选定适当的循环参数。
(一)诊断PCR技术的设计策略
1.扩增片段的确定
为了获得特异的扩增,仅仅知道被检病毒的基因序列是不够的,必须选择病毒基因组上具有独特结构的基因区域进行PCR扩增,这一区域在序列组成或长度上,无论与较近亲缘关系还是较远亲缘关系的其他病毒应有明显的区别。
2.引物设计
引物是影响PCR扩增效率和特异性的关键因素。作为诊断PCR,选择引物应遵循一些基本原则:①引物长度以15～30nt为宜;②正义、反义二条引物链间的距离适中,一般使扩增出的片段在300～1 000bp之间,如果用反转录-PCR检测RNA病毒,引物间距离控制在500bp左右最佳。片段过短则影响电泳结果判定,过长则不易扩增;③引物碱基组成应随机分布,G+C含量在45%～55%左右为宜;④引物自身不形成二级结构,引物间不应有互补序列(4个碱基以上);⑤引物序列必须是被检病毒特异的;⑥原则上引物3’末端碱基与模板DNA一定要配对,此外3’末端碱基最好选T、C或G, 而不选A。
3.PCR缓冲液
PCR反应标准缓冲液应含:50 mmol/L KCl, 10mmol/L Tris•HCl(pH8.3),1-5mmol/L MgCl2和100μg/ml明胶或乙酰化牛血清白蛋白(BSA)。其中Mg2+浓度变化明显影响反应的特异性和扩增效率。Mg2+过多则导致非特异扩增产物增加;Mg2+不足则扩增效率降低。为了取得最佳扩增效果,可先行预实验,以确定最佳Mg2+浓度。
4.引物量
PCR反应中所用引物浓度通常在0.1～0.5 μmol/L之间。浓度过高将出现非特异片段的扩增,过低则不能扩增出足够的特异带,最佳用量可以通过系列浓度实验来确定。
5.dNTP
dNTP(dATP,dTTP,dCTP和dGTP)溶液的pH值应调至7.0。在标准PCR反应中,每一种dNTP的使用浓度为50～200 μmol/L(足够产生7～25μg DNA),更高浓度dNTP将导致错误掺入,从而影响扩增序列的真实性。
6.Taq DNA聚合酶
PCR反应中,该酶的用量,通常是2-5单位。加酶量过多将导致非特异性片段的扩增。
7.变性剂
反应中加入适量变性剂(如二甲亚砜、尿素、甲酰胺等)可减少模板的二级结构,提高反应的特异性。我们在用PCR扩增猪瘟病毒cDNA片段的反应中,加入5%甲酰胺,不但提高了反应的特异性,而且目的cDNA片段的产量大大提高。
8.循环参数
用3种不同温度处理样品,使之变性,退火和延伸,就可进行PCR循环。
变性是循环的第一步,变性不完全,扩增明显受到影响,变性温度太高或时间太长, Taq DNA酶的寿命受到影响,使得循环次数明显减少。绝大多数PCR变性温度在92～94℃之间,时间通常控制在40秒左右。
退火是循环的第二步,退火温度的选择决定着引物与模板互补结合的效率和特异性,是PCR能否成功的关键因素。选择适当的退火温度,取决于引物的长度、G+C含量、模板的纯度和丰度。较高的退火温度可提高引物与模板配对的特异性,从而提高反应的特异性。就含量和纯度较高的模板而论,对于G+C含量在50%左右的约20nt长的引物,55℃是常用的退火温度。如果引物较短(12～15nt)退火温度可降至40～45℃。对于丰度极低的模板的PCR,特别是稀有RNA模板的反转录PCR(RT-PCR),在最初的1～5个循环可以用更低的退火温度,然后再行正常的退火温度,这样能明显提高PCR的成功率。我们在猪瘟病毒和犬瘟热病毒基因组RTPCR扩增中,第一次循环的退火温度用37℃,从第二次循环开始改为50℃退火,成功地扩增出了常规退火温度下没能扩增出的特异cDNA片段。无论什么样的退火温度,时间通常控制在50秒左右。
循环的最后一步是延伸,由于Taq DNA聚合酶只有在高温下才能发挥最大活性,所以延伸在70～75℃温度下(通常在72℃)进行,但延伸反应的时间随欲扩增片段长度的增加而适当延长。一般来说,每扩增1kb的片段,用1分钟时间是足够的。温度及时间确定以后,PCR循环次数主要取决于模板量。但循环次数通常选定在25～30次,经过这些次数循环后,PCR产物的累积即可达到电泳后肉眼可见程度。除非模板浓度极低,如只含一个拷贝,循环可增加至40次。
目前双温PCR正逐渐被采用,其特点是退火与延伸在一个温度下进行,这一温度通常在68℃左右。双温PCR大大简化了操作程序，缩短了操作时间，同时明显提高了反应的特异性。
(二) PCR用于DNA病毒的检测
无论单链或双链病毒DNA，均可用PCR进行检测。检测样品可以是纯化DNA,也可以是细胞、组织及任何可能含有病毒的样品。一般无需提取DNA,可直接取少量样品(少于10μl),煮沸变性10分钟后进行PCR测定。如前所述,PCR检测需要两个特异的DNA引物,引物之间的距离(决定扩增DNA片段的长度)控制在0.3～1kb之间最佳。如果扩增片段达2～5kb,PCR反应产物在随后的电泳中,可能出现多条DNA带,这时往往需要用Southern 转移杂交来鉴定哪一条是病毒特异的带。为了尽量减少PCR的非特异反应,可进行如下调整。
1.增加DNA引物的长度。一般引物长15～20碱基,但可以增加到25～30碱基;
2.引物加长后,提高退火温度,增加反应的特异性;
3.选择其它DNA序列重新合成特异的DNA引物;
4.如果病毒的序列来源于cDNA,则应考虑到某些病毒DNA上含有内含子,可能使被扩增的片段远远大于原设计,甚至无法得到这样大的片段。
(三)PCR用于RNA病毒的检测
由于Taq或Vent DNA聚合酶不能以RNA为模板合成cDNA,所以不能对RNA病毒核酸进行直接PCR。首先必需提取病毒RNA,加入反转录酶合成cDNA,然后才能进行PCR扩增—反转录-PCR(RT-PCR)。RT-PCR必需进行两步反应(反转录酶不耐热)。病毒RNA可以从各种适合的组织器官、排泄物、分泌物或细胞培养物中提取,这取决于被检病毒的种类。RT-PCR同样具有很高的敏感性。作者从100μl猪瘟兔化弱毒的犊牛睾丸细胞培养物中提取了病毒RNA,用下述RTPCR方法,从中扩增出了特异cDNA片段。
(四)PCR用于分子流行病学研究
病毒在自然界中产生自发突变株是长期困扰病毒学工作者的棘手问题。例如流感病毒、牛病毒性腹泻病毒、脊髓灰质炎病毒、口蹄疫病毒等都会因地理或生态环境，动物体的内环境(如易感性、免疫压力等)，气侯和时间因素等的变化而自发产生基因突变的变异株,使人或动物的免疫系统无法正确识别,导致原有的疫苗接种失败,造成病毒大量传播。
就其本质来说,病毒发生突变是指病毒基因的缺失、插入、交换和基因点突变等。PCR技术的出现,使人们有可能大规模、且十分精细地研究病毒突变的规律及突变位点,迅速地鉴定突变株,从分子水平上阐述病毒病的流行规律,这是目前分子流行病学的主要研究内容之一。
在可能发生缺失的病毒基因两侧合成DNA引物,进行PCR或RT-PCR,通过电泳即可清楚地看到被扩增的片段小于对照株;如果外源基因插入某个位点,用这个位点两侧的DNA引物进行PCR扩增,就可以发现扩增的片段大于对照株。
美国科学家用多种因素(化学、物理)处理脊髓灰质炎病毒,然后制备cDNA。对混合的cDNA进行PCR,发现了多种不同的突变株。他们还使用PCR研究不同口蹄疫毒株之间的重组。他们首先在两个毒株的核酸序列上寻找两个非同源序列,合成DNA引物。引物Ⅰ只能与A株杂交,引物Ⅱ只能与B株杂交。因此,用这两个引物不能对A株或B株的cDNA进行扩增。将A、B两株在不同条件下混合感染单层培养细胞,提取病毒RNA制备cDNA,最后用引物Ⅰ和Ⅱ进行PCR。如果电泳中发现特异的DNA带,同时此DNA带能与32P标记的两个DNA引物杂交,则说明A、B两株的基因组RNA在两个DNA 引物中间的序列发生了基因重组。用此方法可以迅速准确地测定试验室内病毒发生基因重组的条件。令人惊奇的是经PCR扩增后,电泳中往往出现多条分子量不同的带,核酸序列分析说明A、B两株间有多个不同的重组位点。有人采用RT-PCR技术,对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的基因突变进行了研究,发现许多致细胞病变BVDV毒株的P80基因区有外源核酸序列的插入(大小约数百个碱基),而非致细胞病变毒株则没有这种插入。
当然,PCR结果还难以说明病毒遗传变异株的稳定性、毒性、滴度、致病性等多项病毒学指标,然而这些研究结果说明了病毒间基因重组的复杂性和重组的条件,使人们有可能着手研究病毒重组突变机理。
六、病毒基因组的限制性内切酶图谱和寡核苷酸指纹图
病毒核酸是人们已知的生物遗传物质中最为简单的一种,因此病毒学家有可能比较深入地研究病毒的基因结构,这也是病毒遗传学进展快于遗传学其它领域的原因之一。例如,目前人们已经测定了几百种病毒的全基因序列,而在细菌中仅完成了大肠杆菌(E.coli)的全基因测序。因此很多生物学家希望通过对病毒遗传学的研究了解生命的某些规律,以应用于包括人类在内的其它生物遗传学研究。
(一)病毒基因组的限制性内切酶图谱
病毒基因组核酸的碱基数在3～300kb之间。300kb以下的病毒DNA经内切酶水解,进行琼脂糖凝胶电泳染色后,可以观察到清晰的DNA带,而其它生物染色体DNA水解后只能看到弥散的DNA带。由于病毒核酸的这一特性,使人们可以制备准确的病毒基因组核酸酶切图谱,利用不同的内切酶切割病毒DNA,依据切割后的片段在凝胶电泳中泳动速率不同所形成的电泳带型做出诊断。如单纯疱疹I型与II型的鉴别以及肉食兽细小病毒的鉴别诊断等。
病毒基因组的限制性内切酶图谱,或称物理图谱,是指描绘病毒双链DNA上各种不同限制性内切酶的酶切位点分布情况、限制性片段大小及其排列顺序的图谱。准确的内切酶图谱是将病毒的全部DNA序列输入电脑,用特别的软件系统(如DNA star)判读序列,由电脑绘出所有已知内切酶的酶切位点。如果尚未测定某种病毒DNA的全部序列,则需用部分消化法(partial digestion)逐一测定不同内切酶的位点。
绘制内切酶图谱,必须采用病毒的线状双链DNA,进行各种内切酶的部分消化。对于单链DNA病毒要提取其复制过程中的双链中间型;部分单链的病毒DNA,需要有DNA聚合酶Klenow片段补成双链;对于RNA病毒目前尚没有商品化的RNA限制性内切酶(Ribozyme除外)可用于制备病毒RNA的酶切图谱,因此所谓RNA病毒的酶切图谱,实际上是病毒RNA制备的cDNA酶切图谱。通常先将病毒cDNA克隆到质粒上,利用质粒上已知的酶切位点进行末端标记,分离一端标记片段进行部分水解测定,得到酶切图谱。如果病毒DNA是环状,则必须用只有一个切割位点的内切酶将环状DNA切成线状DNA。通常提纯的病毒DNA量很少,要用同位素32P末端标记法标记后再进行部分酶切分析,分析方法简述如下:
(1)用末端标记法,对线性化病毒DNA的2个5末端进行同位素标记,通常用γ-32P-dNTP进行标记;
(2)选择一种在病毒DNA上只有一个酶切位点的内切酶,将标记的病毒DNA切割成左、右两段;
(3)琼脂糖电泳分离标记的左、右两个片段,这两个片段均为一端32P标记DNA;
(4)将一种内切酶按正常工作浓度稀释10、100和1 000倍,按常规方法酶切标记的左端DNA片段,电泳后放射自显影,以决定部分消化的最适酶工作浓度和时间;
(5)部分水解可以产生多种不同的DNA片段,计算放射自显影片段的分子量,即可标出所用内切酶的切点在左端DNA片段上的位置;
(6)同样的酶切测定右端标记片段;
(7)用其它内切酶进行同样的实验,以测定其切点的位置。
这种方法测定的内切酶图谱精确度在0.1～0.5 kb之间,如果在0.1kb的DNA片段中有两个以上相同的酶切位点,则需用DNA序列分析法测定准确的位点。
(二)病毒寡核苷酸指纹图(Oligonucleotide fingerprinting)
目前已经发现数百个血清型的RNA病毒,此外还发现由于病毒基因组在不断进化过程中所产生的越来越多的亚型和变异株。对同一病毒不同毒株的比较以及抗原性相似而基因结构有差别的病毒之间的鉴别诊断,如口蹄疫病毒和流感病毒等抗原变异分析,狂犬病毒和脊髓灰质炎病毒等疫苗株与野毒株的鉴别等,应用常规的血清学方法(如中和、琼扩、补反和血凝抑制等试验)往往难以奏效。然而应用寡核苷酸指纹图分析,就能容易地区别这些即使基因组核苷酸序列只有微小差异而遗传关系十分接近的RNA病毒株。通过比较同一血清型不同毒株的RNA指纹图就能鉴别这些毒株在遗传上的远近关系或在进化上的先后顺序,研究流行毒株的起源及其扩散的去向,毒株的变异规律及突变机率以及监控疫苗株的遗传稳定性等。
此外,寡核苷酸指纹图还可用于:①研究RNA病毒基因组结构的复杂程度,例如是否含有重复序列;②分析分节段的病毒基因组RNA;③鉴定RNA病毒基因组的重组或重排;④绘制RNA病毒的基因图谱;⑤分析缺失干扰病毒RNA的种类和产生机制;⑥鉴定病毒mRNA的种类。
寡核苷酸指纹图的基本原理是用一种核酸酶对纯化的病毒RNA(同位素标记)进行消化。通常使用核糖核酸酶T1(RNase T1),此酶特异作用于鸟嘌呤核苷酸(G)3’端磷酸,并专一切割与相邻核苷酸相连的磷酸二酯键,产生3’末端带G的寡核苷酸。所产生的寡核苷酸片段通过双相电泳分离后,进行放射自显影,每一种寡核苷酸片段就出现象指纹一样的图谱。由于病毒不同,其基因组的大小、G的含量和分布均不相同,所以T1酶消化后就会产生许多理化特性和大小不尽相同的寡核苷酸片段。经聚丙烯酰胺凝胶双相电泳和放射自显影后就会在X-光片上出现不同的寡核苷酸指纹图型。
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