细胞技术统计交流
从事一些细胞培养技术方面总结统计工作，对细胞查询国内库有些了解，查询细胞，及培养特性一直做些总结，还要向各位老师学习交流。案例及经验交流（悬浮细胞注意事项）-NK92
悬浮细胞或NK92细胞阶段总结经验及建议，不对处望老师指正，以下是悬浮细胞用冻存液注意事项(通过对NK92细胞及相关悬浮细胞销售，售后，技术交流，统计等服务工作，建议对悬浮细胞冻存挑剔提出几点建议供参考：
冻存液配置：建议头天配好后-4度保存，第二天用。
冻存步骤建议：两指厚棉包裹后，直接-80保存一天后，第二天液氮。
复苏步骤，因悬浮细胞常出现此类问题，上述两项注意后，复苏如果不理想，可放培养箱2-4周，不用管他，大部分情况细胞可复苏过来，一般细胞透亮，复苏成功率更高。很多案例说明，这类细胞能从很少几个细胞培养到理想状态，欢迎各位老师交流培养过程中问题解决方案及经验。
冻存液配置建议：90%血清里加百分之十的DMSO，然后加200单位没毫升的IL2。（该细胞生长依赖特点，适合NK92细胞）
如团聚厉害，后期影响细胞状态，建议离心后用胰酶消化下，总只细胞吹打等方法都可以，尽量把细胞消化成单个的细胞。后期实验会顺利些。建议用0.05胰酶消化时间可稍长，虽然胰酶浓度低，可稍长时间消化，会使细胞尽量消化成单个细胞。（另因很长时间生长的难消化细胞，我们意见是，培养条件不适合，生长缓慢。不适合此方法，建议筛选适合的培养条件）
细胞培养-成团成片统计交流
目前统计问题成团成片常见细胞：后续解决方案稍后总结好后发您共享，希望各位老师参与我们统计活动。
比较常见细胞：
绒癌细胞JAR结肠癌LOVO细293细胞肝星状细胞原代神经神经干细胞A7R5平滑肌细胞MCF7细胞 PC12 PK15和ST成骨细胞NRK细胞,calu-3，T-47DHCT-8 胰腺癌BXPC-3 成纤维细胞sw480 Vero HepG2 海马神经元原代培养细胞、成团生长的癌细胞如何消化成单细胞上流式 SH-SY5Y细胞 HCT－116C2C12肺癌的原代 原代乳腺癌细胞 原代乳鼠大脑皮层神经细胞白血病细胞系UKE1u87细胞生长成团SK-OV-3细胞 4T1细胞离心后细胞成团怎么办HepG2.2.15细胞成团生长 YAC-1成团现象严重！！ HL-60细胞培养的成团现象?LS 174T 细胞一直聚团，不容易消化 大鼠肺成纤维细胞 PC9细胞 HCT细胞 MSC
统计建议方案：
一：低浓度胰酶稍长时间消化，贴壁与悬浮可回信
二：胰酶前一步，etda直接消化。
三：DNAsa裂解。
后两种方法有效果的老师，建议留下详细操作步骤。
试剂引起的细胞状态老化，请区别下。还有较好的血清也会引起细胞成团（有些血液类）要与试剂引起的老化要区分。上述建议沟通前，列出细胞来源，详细培养方法。细胞状态描述。
有更好方法的老师可回信告知，说的不对处，请老师指正。 细胞培养应用一 禽腺病毒全病毒及基因工程疫苗技术
目前，绝大部分疫苗厂家都已采用 LMH 细胞生产禽腺病毒疫苗，但由于 LMH 细胞的 易聚团、难贴壁等特性，因此，在疫苗产业化过程中大规模培养 LMH 细胞有一定困难， 而且病毒滴度低，基本都在 107.0/0.1ml 左右，极大地限制了产能。本公司经过多年研究 建立了一种新型 LMH 细胞的培养方法，利用特殊的集全新细胞贴壁与病毒增殖于一体的 独特技术，使 LMH 细胞贴壁时间大为缩短，而且细胞培养 192h 后仍保持较好细胞形态， 易于禽腺病毒病毒的复制与增殖及后续毒价测定。4 型禽腺病毒病毒 TCID50 效价大于 108.5/0.1ml，目前 1ml 全病毒培养液可配制 200 羽份疫苗，可 100%保护 SPF 鸡免受 4 型禽腺病毒强毒的攻击（未免疫组攻毒 72h 后 100%死亡）。该试验结果由不同厂家不同 专业人员多次在细胞工厂上验证完成
该技术关键技术是贴壁试剂的应用，目前该株细胞已传70代，细胞无任何影响。
科研用户贴壁试剂应用细胞有：LNCAPA172
近期实验293慢病毒腺病毒转染技术储备案例充足，转化预期快。 血液类细胞:这类细胞筛选血清较准确-目前正在统计转染
THP-1,HL-6 RAW 264.7J774A.1K562MOLT-4 JurkatDaudiRAJIU937 NK92YTYTS
我司准备对血液类细胞对国外来源身份明确的细胞准备保种，目前我们熟悉并处理的有THP-1,HL-60等几株协和来源细胞与用户做了成熟培养体系的试剂评测统计后推荐，目前对OCI -Ontario Cancer Institute 安大略癌症研究所机构来源的OCI-Ly1, OCI-Ly2, OCI-Ly3, OCI-LY4, OCI-Ly7, OCI-Ly8, OCI-Ly12, OCI-Ly13.2, OCI-Ly17, and OCI-Ly18, by G-banding, SKY, and CGH,这几株细胞有兴趣保种，如有STR数据，有必要，我们在国内可做STR进行细胞鉴定。提供细胞的实验室，可免费享用我们库的该类细胞。保种优势是，血清培养基耗材等试剂都要原装进口。加上多年的培养经验。已用过国产试剂耗材的细胞暂时不考虑。
发信的目的是，统计后很多实验室试剂培养体系不太适合血液类悬浮细胞培养，包括冻村步骤与复苏步骤。（附件是我们统计总结后的一些小经验）其他细胞基础经验交流可来信标明.
去除外泌体血清说明书有需要可来信说明
相关其他经验交流统计：好血清促使细胞团聚，该类细胞有这些特性，我们目前解决办法是，离心后低浓度胰酶消化下解决团聚。
血清试用可发我们实验室名称，采购负责老师姓名电话后，可发试用装（20ML)
----------------悬浮细胞培养注意事项
售后案例及经验交流（悬浮细胞注意事项）-NK92、THP-1血液类
悬浮细胞或NK92、thp-1细胞阶段总结经验及建议，不对处望老师指正，以下是悬浮细胞用冻存液注意事项(通过对NK92细胞及相关悬浮细胞销售，售后，技术交流，统计等服务工作，建议对悬浮细胞冻存挑剔提出几点建议供参考：
冻存液配置：建议头天配好后-4度保存，第二天用。
冻存步骤建议：两指厚棉包裹后，直接-80保存一天后，第二天液氮。
复苏步骤，因悬浮细胞常出现此类问题，上述两项注意后，复苏如果不理想，可放培养箱2-4周，不用管他，大部分情况细胞可复苏过来，一般细胞透亮，复苏成功率更高。很多案例说明，这类细胞能从很少几个细胞培养到理想状态，欢迎各位老师交流培养过程中问题解决方案及经验。
冻存液配置建议：90%血清里加百分之十的DMSO，然后加200单位没毫升的IL2。（该细胞生长依赖特点，适合NK92细胞）
如团聚厉害，后期影响细胞状态，建议离心后用胰酶消化下，总只细胞吹打等方法都可以，尽量把细胞消化成单个的细胞。后期实验会顺利些。建议用0.05(或浓度更低）胰酶消化时间可稍长，虽然胰酶浓度低，可稍长时间消化，会使细胞尽量消化成单个细胞。（另因很长时间生长的难消化细胞，我们意见是，培养条件不适合，生长缓慢。不适合此方法，建议筛选适合的培养条件）
成团问题希望今后与各位老师一起统计学习。
消化后成片问题正在统计中，希望与老师们一起找到理想的解决方案。
-------------------转染
悬浮细胞转染目的（电转及转染），细节分析统计（我司对细胞较了解，有交流的老师可沟通）
一：转染细胞贴壁时间，新铺板的细胞跟容易转染进去，细胞未贴壁。思考：转染物质轻重，如果在底层，细胞贴壁过程促进转染？
二：1640钙物质是否有影响，无钙1640或opti-mem
三：玻璃瓶对转染实验影响相对小。
四：操作步骤，建议能旋转培养瓶，让转染物质有条件进入细胞。（超声震动也准备上实验试试）
五：能否用我们贴壁试剂，将细胞贴壁后做转染。（有兴趣用该方法的老师可来信注明）
六：免疫细胞（大部分免疫细胞是悬浮细胞）是否有对外来物质有免疫保护，细胞膜研究能否给些建议。或技术老师的经验办法方案能否配合解决
七：低温对转染物质的影响（超声震动也准备上实验试试）
八：通过对几个工业用户咨询，建议质粒要用凯杰大提或维格拉丝大提，其他牌子的不建议用，后续影响实验。
---质粒
九：质粒提取，要用无内毒素质粒抽提试剂盒
十：慢病毒质粒的目的基因大小建议小于4kb，大的成功率很低
十一：建议在质粒中加入荧光报告基因和真核抗性筛选标记，便于筛选阳性克隆和检测转染效率
十二：传代的离心步骤加入聚乙烯亚胺转染试剂(Polyethylenimine）或脂质体与转染载体，离心后直接培养
十三：NK细胞，DC细胞 大厂家培养基长期统计评测，及含血清方案统计 life:AIM V培养基、LONZA:VIVO-15
细工生物技术交流（来信标注悬浮转染） 乳腺癌类细胞国内大概情况
https://www.keyword-suggest-tool.com/search/atcc+human+cell+lines/
国内已有细胞已上手培养统计总结问题交流 培养技术细节有些经验 前提是进口试剂耗材（列出试剂耗材厂家货号目的是统计总结才有意义）
MCF-10A MDA-MB-453 BT-549 MDA-MB-468 Hs578T MDA-MB-157 HCC-1428 SW527 SUM-52PE HCC-1937 MDA-MB-231 MCF-7 CAMA-1 BT-474 SUM190PT SK-BR-3 ZR-75-1 ZR-75-30 T-47D
未上手准备统计总结培养要点
准备寻找正规库来源或实验室进口试剂耗材国外来源 有培养经验的老师能否留下培养细节关键点 建议进口试剂耗材可沟通
DU4475 HCC-38 CAL-851 HCC1-806 SUM159 SUM149 MCF-12A HCC-1187 HCC-1569 CAL-120 HCC-1143 CAL-148 HCC-3153 MDA-MB-134-V HCC-70 SUM1315M02 CAL-51 EL-12-58 SUM185PE MDA-MB-436 HCC-1395
MEM223-ecacc-98050130
欢迎国外实验室参与：细胞培养技术交流、研究方向统计交流、细胞经验交流（上述国内培养有些经验，欢迎常年深入交流，需实验合作实验室可PM我）
要点
消化步骤：在倒置显微镜下观察细胞，直到细胞层分散（通常在5至15分钟内）注意：为避免结块，在等待细胞分离时，不要通过敲击或摇晃烧瓶来搅动细胞。难以分离的细胞可放置在37°C以便于分散
新的培养血管中加入适量的细胞悬液
冷冻培养基：完全生长培养基，95%；二甲基亚砜，5%
以上试剂耗材都要原装进口 293细胞慢病毒包装新预期结果准备做下（后面实验结果做完在公布） 有病毒低度要求高的老师 可来信交流
细胞培养相关参考-铜-in-out
本帖最后由 procyte 于 2020-4-27 00:08 编辑细胞培养相关参考-铜-in-out
William's E media is supplemented with 0.4 µMcopper
Ham's F-10 or F-12 media for low serum and serum-free applications. The original Ham's F-10 and F-12 media were supplemented with 10 µM copper.
DMEM/Ham's Nutrient Mixture F-12contains 0.0052 µMcopper
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) 常被用作开发无血清杂交瘤培养基的基础配方中不含铜。然而，这些培养基经常补充白蛋白。白蛋白是铜的一种生理转运分子，纯化的天然白蛋白可能含有足够的铜，至少部分地支持培养中的细胞。-杂交瘤
氯化铜 二水合物 powder, BioReagent, suitable for cell culture
C3279-100G100 g 424.94
C3279-500G500 g 1,513.94
硫酸铜 五水合物 Copper(II) sulfate pentahydrateBioReagent, suitable for cell culture, ≥98%
C8027-500GToolTipBottom 500 g 919.40
相关研究
在动物细胞体外培养阶段，铜离子是不可或缺的添加剂成份，在培养液中的浓度影响着细胞的生长和代谢。铜离子在细胞内以辅基的形式参与许多重要的代谢途径，作为酶的辅助因子驱动细胞呼吸、神经递质的传递、铁离子的摄取和抵抗氧化应激等重要的生理过程。
有研究表明，铜进入机体主要是以酶的辅助因子形式参与氧化磷酸化、自由基解毒、黑色素合成、儿茶酚胺代谢、结缔组织交联、血液凝固和毛发形成等代谢过程。含铜酶的活性是受铜离子调控的，添加铜可提高细胞内CuZn-SOD的活性。CuZn-SOD
能消除自由基对机体的毒害作用，从而改善机体代谢的内环境，促进机体生长发育。
在细胞内铜离子浓度过低时，会影响相关酶的活性及相应的生理代谢途径，进而影响细胞的正常生长 ；相应的细胞内铜离子浓度超过细胞的生理需求时，促进形成自由基，同时能氧化蛋白，脂类和 DNA，造成细胞膜电位的下降进而引起细胞的死亡。
牛血清中含有较高浓度的铜离子，在细胞基础培养基中加10% 牛血清时铜离子可浓度达到50～120ng/ml，其处于细胞可接受的生理范围内，因此不需要额外补铜。如使用无血清培养基，则应注意培养基中的铜离子浓度。
铜内胆的细胞培养箱
美国EPA(环保署)等多家世界权威机构的科学证明，抑菌铜在两小时内杀死超过99.9%的细菌，成为全球最有效的接触面材料。具有抗菌性能的表面材料，能有效地控制医院中各类抗药性细菌的生长，比如令人恐惧的肠细菌、葡萄球菌和大肠杆菌等。任何其他材料（例如银离子涂层或不锈钢）都无法与之相比媲美。
铜能够快速杀死MRSA这样的超级细菌，并且令细菌无法产生抗体，铜质水龙头内壁不会滋生细菌，这是其他材料(如：不锈钢、塑料)所不具备的优势。纯铜内胆，细胞培养的明智之选.
铜腔体 CO2 培养箱
Steri-Cycle i160 灭菌Steri-Run (180°C)
Steri-Cycle i250 灭菌Steri-Run (180°C)
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