wwwkkk83 发表于 2015-5-21 23:56:05

从DNA到E6、E7 mRNA —— 高危型HPV检测技术的发展

目前,美国FDA相继共批准了4个宫颈癌相关高危型HPV检测,依次分别是基于杂交捕获技术的Hybrid Capture 2,基于酶切信号放大技术的Cervista HPV,基于实时荧光PCR技术的Cobas HPV,和基于转录介导等温扩增技术的Aptima HPV。前三种HPV检测,虽然采用不同的技术原理,但都是检测HPV DNA的,属于第一代的高危型HPV病毒检测方法,而最新被FDA批准的Aptima HPV是唯一针对高危型HPV E6、E7 mRNA 的检测,属于新一代的检测。

HPV DNA -- 第一代高危型HPV病毒检测 方法的局限性

80% 以上的妇女一生中都会感染HPV病毒,而90%以上的感染是一过性感染,在8-24个月内,被自身的免疫系统清除,只有不到10%会发展为持续性感染。第一代的HPV DNA检测,虽然据有较高的临床敏感性,实现了对高级别癌前病变(CIN2+)的检出,但是,其特异性较低,阳性结果中绝大部分是一过性感染导致的假阳性结果(无组织学高级别病变),这主要是由于 HPV DNA是结构基因,一旦发生感染,就能检测到。而这些“假阳性”结果,会给“患者”带来不必要的心理压力,由此带来后续不必要的创伤性检测(阴道镜和组织活检),对患者身体造成伤害,浪费有限的社会医疗资源,并引发一系列家庭和医患关系等社会问题。

检测HPV E6、E7 mRNA 的新一代检测方法的技术优势

E6、E7基因是高危型HPV 病毒的两个致癌基因,其通过转录mRNA实现癌蛋白的表达,从而改变细胞正常代谢,导致细胞发生病变直至癌变。在病毒感染的早期,病毒基因在细胞内为游离状态,此时E6、E7基因处于静默期,不表达或低表达mRNA,一过性HPV感染大多处于这个阶段。当HPV病毒发生持续感染后,病毒基因和人类基因发生整合,E6、E7基因被激活,利用宿主细胞大量转录mRNA、从而导致大量癌蛋白的表达,细胞发生高级别病变的风险大大增加。

简而言之:

•高危型HPV病毒DNA存在,不一定会导致细胞发生癌变。

•只有当病毒持续性大量转录E6、E7mRNA,从而大量表达E6、E7癌蛋白,才会导致细胞发生癌变。

所以检测高危型HPV病毒的E6、E7 mRNA相比检测HPV DNA,可以更加精准的筛查“病变”,有效降低对一过性感染的检出率。



Aptima HPV,在近20项约5万例全球临床研究显示:与第一代的HPV DNA相比,具有同样的临床敏感性、阴性预测值, 同时显著提高了检测的特异性。可减少15-40%的假阳性(一过性病毒感染),从而显著减少感染者不必要的心理压力,减少不必要的阴道镜组织学诊断。

高危型HPV检测从DNA进入了E6、E7mRNA的时代,从而为实现宫颈癌的精准筛查,更近了一步。

wwwkkk83 发表于 2015-6-21 06:21:08

HPV E6/E7 mRNA 联合液基薄层细胞学检测在宫颈病变中的诊断价值
doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.09.020
摘要:
目的:评价人乳头瘤病毒(HPV)E6/E7 mRNA检测联合液基薄层细胞学(TCT)方法在宫颈病变中的诊断价值。方法对750例高危型HPV DNA阳性患者分别进行TCT、HPVE6/E7 mRNA检测和阴道镜病理活检,比较HPV E6/E7 mRNA在各宫颈病变中阳性率的差异,以及比较单独检测和联合检测在宫颈病变中诊断价值的差异。结果750例高危型HPV阳性患者进行阴道镜活检检出宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌293例,E6/E7 mR-NA阳性患者占286例,各种宫颈病变(意义不明不典型鳞状细胞、低度鳞状上皮内瘤变、高度鳞状上皮内瘤变、鳞状癌变)患者HPV E6/E7 mRNA阳性率差异有统计学意义( P<0.05)。单用TCT检出CIN阳性256例,单用E6/E7 mRNA检出CIN阳性247例,两者比较无统计学差异,单用TCT或E6/E7 mRNA检测出CIN阳性率均低于联合检测(P均<0.05)。结论 HPV E6/E7 mRNA检测联合TCT方法可降低宫颈病变的漏诊率,优于单独检测。

wwwkkk83 发表于 2015-8-26 12:01:46

取材须知取材前 取材应尽可能避开经期,取材前24小时不上药、不冲洗、不过性生活。分泌物较多时,可在取材前用棉签轻轻粘去,不可用力擦。
取材 取材时扫帚状采样器从子宫颈上采取足够量的样本。将扫帚状采样器的中央刷毛部分轻轻的深插入子宫颈的通道内,以便较短的刷毛能够完全接触到子宫颈。柔和的向前抵住采样器,并按同一个时针方向转动扫帚状采样器5-8周整。切勿来回转动。取样过程中宫颈出血明显时,应立即停止。
漂洗 将扫帚状采样器推入保存液小瓶底,迫使刷毛全部散开来,共10次。最后,在溶液中快速地转动扫帚状采样器以进一步的将细胞样本漂洗下来,并将大的粘液团从瓶内提出。或直接把刷头拔下来放入标本保存瓶。
运送 将检验条码或标本联根号贴到标本保存瓶空白处,送检。若不能及时送检,可放4°C保存。
注意事项 在一般情况下,尽量避免短期内(小于三个月)重复取材,以免出现假阴性结果。申请单填写应尽量完全,字迹工整,尽可能提供相关的临床信息。
病毒癌基因E6、E7mRNA与宫颈癌的关系:高危HPV病毒感染宫颈癌后,将病毒癌基因E6和E7带入宫颈上皮细胞,癌基因被激活,转录产生E6、E7mRNA,最后产生致癌蛋白E6、E7蛋白,导致宫颈癌。哪些人群应该做病毒癌基因E6、E7mRNA检测?低风险人群:30岁以下、常规体检及液基细胞学检测结果为正常的已婚妇女。高风险人群:液基细胞学检测结果异常(ASC-US,ASC-H,LSIL)的妇女,HPV DNA检测为阳性的妇女。

wwwkkk83 发表于 2015-9-24 14:09:10

E6/E7基因,高危型HPV病毒导致宫颈癌的元凶  环状HPV基因组包括两类编码基因区,即七个早期区(E1、E2、E4、E5、E6、E7和E8)基因和两个晚期区(L1和L2)。L1和L2编码病毒衣壳蛋白,在病毒颗粒自我组装以及侵入目标细胞时起协调和识别作用。而早期区(E区)编码蛋白基因中,E6和E7基因编码的原癌蛋白是导致宫颈上皮癌变的重要因子,这两种蛋白通过抑制两种主要抑癌蛋白p53和视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)使被感染细胞无限增殖并恶性转变。p53的主要作用是发现DNA持续损伤时激活DNA修复蛋白,抑制细胞生长,并当DNA损伤无法修复时会加速细胞凋亡,E6致癌基因过度表达的蛋白抵消了p53的多种抑癌作用,允许出现DNA损伤的细胞能够继续分裂。pRb作为一种抑癌蛋白,则通过调控细胞周期避免细胞过度生长,E7致癌基因表达的蛋白与pRB蛋白结合,导致蛋白降解和与pRb结合的E2F转录因子的释放。这些游离的E2F转录因子会激活许多参与在G1/S期调控点的细胞周期调控基因。这种联合效应使得存在未修复DNA损伤的细胞可以无限增殖并且保持过度增殖状态。5
  低危型HPV E6/E7蛋白在阻碍p53和pRb功能方面不如高危型的E6/E7蛋白强烈。从而,低危型HPV感染仅与良性的细胞增生相关,如,尖锐湿疣和易消退的低级别上皮内瘤变。
HPV 病毒基因整合和E6/E7 mRNA的大量表达  E6、E7基因DNA需要首先被激活,转录大量的E6/E7 mRNA,然后再由mRNA 翻译成相应的癌蛋白。从HPV病毒感染宫颈细胞,到E6\E7 mRNA的大量表达,一般需要经历两个过程:HPV病毒感染细胞早期,病毒基因游离在细胞质中,此时,E6/E7 mRNA处于低表达状态,绝大多数的一过性HPV感染都处于这个阶段,就被机体清除了;当HPV病毒发生持续性感染,特别是当病毒基因进入细胞核,和人类细胞发生整合后,E6/E7 mRNA 发生大量表达,细胞由此逐渐向高级别病变发展。
HPV DNA -- 第一代高危型HPV病毒检测 方法的局限性  80% 以上的妇女一生中都会感染HPV病毒,而90%以上的感染是一过性感染,在8-24个月内,被自身的免疫系统清除,只有不到10%会发展为持续性感染。第一代的HPV DNA检测,虽然据有较高的临床敏感性,实现了对高级别癌前病变(CIN2+)的检出,但是,其特异性较低,阳性结果中绝大部分是一过性感染导致的假阳性结果(无组织学高级别病变),这主要是由于 HPV DNA是结构基因,一旦发生感染,就能检测到。而这些“假阳性”结果,会给“患者”带来不必要的心理压力,由此带来后续不必要的创伤性检测(阴道镜和组织活检),对患者身体造成伤害,浪费有限的社会医疗资源,并引发一系列家庭和医患关系等社会问题。检测HPV E6\E7 mRNA 的新一代检测方法的技术优势  1.高危型HPV病毒DNA是病毒“存在”与否的指标,而E6/E7 mRNA是病毒两个致癌基因“活跃程度“的指标。
  2.只有当病毒持续性大量转录E6\E7mRNA,从而大量表达E6、E7癌蛋白,才会逐渐导致细胞发生高级别病变。
  所以,作为一个新的生物标记,E6\E7 mRNA与细胞“病变”的相关性更好。检测高危型HPV病毒的E6\E7 mRNA相比检测HPV DNA,可以更加精准的筛查“病变”,有效降低对一过性感染的检出率。      
美国高危型HPV检测的最新发展  目前,美国FDA相继共批准了4个宫颈癌相关高危型HPV检测,依次分别是基于杂交捕获技术的Hybrid Capture 2,基于酶切信号放大技术的Cervista HPV,基于实时荧光PCR技术的Cobas HPV,和基于转录介导等温扩增技术的Aptima HPV。前三种HPV检测,虽然采用不同的技术原理,但都是检测HPV DNA的,属于第一代的高危型HPV病毒检测方法,而最新被FDA批准的Aptima HPV是唯一针对高危型HPV 病毒 E6/E7 mRNA 的检测,属于新一代的检测。
      Aptima HPV,在近20项近5万例全球临床研究显示:与第一代的HPV DNA相比,具有同样的临床敏感性、阴性预测值, 同时显著提高了检测的特异性。可减少近40%的假阳性(一过性病毒感染),从而显著减少感染者不必要的心理压力,减少不必要的阴道镜组织学诊断。
      CAP (美国病理学家协会)是国际公认的最权威的实验室管理和国际认证组织。它每年开展3次HPV检测的室间质量评价,2015年最新数据显示,美国使用Aptima HPV参加CAP室间质量评价的实验室数量是最多的。http://www.alabmed.com/uploadfile/2015/0924/20150924102842708.png
高危型HPV检测从DNA进入了E6\E7mRNA的时代,从而为实现宫颈癌的精准筛查,更近了一步。
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