cao1976 发表于 2015-7-21 09:27:23

[转移贴]提取黄瓜花叶病毒的dsRNA

原贴由mimisikai再生 发表于 2007-8-17 08:03

这个是我们实验室提取dsRNA的经典方法,比较成熟好用
CMV应该很好提阿,他们很多人都在提,我也帮着做过几次,效果很好,方法如下,这个是小抽,有些细节需要注意,原理很简单,细胞破碎后,取核酸先吸附后洗脱,大抽可能更容易但比较费时
dsRNA提取操作方法如下:
1) 称取0.5 – 0.6 g去脉的鲜叶组织,在液氮中充分研磨;
2) 加入0.5 ml 2 × STE(pH8.0),15 µl β-巯基乙醇,0.3 ml饱和酚,0.2 ml三氯甲烷,70 µl 10% SDS,充分匀浆5 min;
3) 4ºC,12000 rpm,离心5 min,收集上清;
4) 上清用无水乙醇调至乙醇终浓度为17%的混合液,充分混匀;
5) 称取0.06 g纤维素(CF-Ⅱ,Sigma)加入1.5 ml离心管中,用含16%乙醇的1×STE浸泡1 – 2 h,12000 rpm离心1 min,弃上清;
6) 组织上清混合液加入到含有纤维素的离心管中,充分匀浆5 min;
7) 4ºC,12000 rpm,离心5 min,弃上清;
加入1 ml含有17%乙醇的1 × STE混合液,匀浆5 min;
9) 4ºC,12000 rpm,离心5 min,弃上清;
10) 重复步骤8)、9)4次;
11) 加入0.3 ml不含乙醇的1×STE,充分匀浆5 min,
12) 4ºC,12000 rpm,离心5 min,收集上清;
13) 加入0.3 ml不含乙醇的1 × STE,重复步骤12)、13);
14) 收集的上清加入等体积的异丙醇,混匀后室温静置10 min;
15) 4 ºC,15000rpm,离心15 min,弃上清;
16) 用150 µl 70%乙醇洗沉淀,稍离后,弃上清,真空干燥3 min;
17) 沉淀溶于20 µl TE;
1 取5 µl在1% 琼脂糖凝胶上电泳,初步比较样品中携带dsRNA的情况,然后在5%的PAGE胶上电泳,进一步观察dsRNA条带的数目及比较分子量的大小;
19) 根据电泳所显示的双链RNA条带的大小,确定待检测病毒基因组RNA并与已知RNA病毒的dsRNA或相应DNA分子量Marker进行比较,初步诊断待检测病毒种类。

cao1976 发表于 2015-7-21 09:28:03

zyj83114 发表于 2009-4-12 11:04 :请问如何确定所提的产物就是dsRNA呀?dsRNA大小条带是不是跟所提dsRNA所对应的病毒基因组大小一致呀?
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