病毒载体大课堂之AAV载体的研究-----多多跟贴，多多想法，...
http://biosky.haotui.com/viewthread.php?tid=7640&extra=page%3D1%26amp%3Bfilter%3Dtype%26amp%3Btypeid%3D97篇章一：基因治疗中的AAV载体
基因治疗是将治疗基因导入人体靶细胞以达到治愈疾病的目的。随着研究的进展，如何将治疗基因导入靶细胞，并使其在靶细胞中得到高效表达已成为基因治疗中的关键问题。目前，治疗基因的导入方式主要集中在使用载体和直接注射两种方式。载体包括病毒载体和非病毒载体，其中病毒载体具有良好的靶向性。随着人们对腺相关病毒（AAV）的深入了解，AAV载体得到了越来越多的基因治疗专家的青睐。
AAV载体的优越性主要表现在以下几个方面：
⑴安全：到目前为止尚未发现一例因为使用AAV载体而导致的医疗事故。
⑵组织或细胞嗜性范围广：AAV存在多达12种血清型和120种以上的突变体，其各自的组织或细胞嗜性决定了在基因治疗过程中对多种靶细胞的广泛应用。
⑶能够感染分裂与非分裂的细胞。
⑷长期表达：能插入到宿主细胞染色体内或以染色体外附加体的形式长期存在且稳定表达。
⑸定点整合：如此避免了类似于腺病毒的随机整合所可能造成的对正常功能基因片段的断裂或者激活癌基因。其原理是在P5启动子和Rep78/68存在的情况下就能导致在人19号染色体上AAVS1位点的特异整合。
附加：到目前为止，虽然说野生型AAV能有效地整合在19号染色体，但重组后的AAV载体的整合功能并没有在人体内表现出任何证据。尽管如此，在高光坪教授的实验中的小鼠的肝脏在培养8年后仍能表达目的基因，这也在一个侧面说明了整合的存在性。
----------以上及以下内容系本人整理及部分原创性观点，转载请附上中国病毒学自由学术论坛病毒载体专题
篇章二----AAV的生物特性
AAV属于细小病毒家族。其病毒颗粒为直径约20 nm的二十面体结构，分子量为5.5～6.2.×106D，在CsCl梯度中密度为1.39～1.42g/cm。与其他病毒相比，AAV的理化性质稳定，能耐受65℃的高温以及多种有机溶剂如CCl4,其结构在pH3~9的范围内保持稳定。-----在分离纯化过程中可以利用这些特性。
AAV基因组为线性单链DNA，大小为4.6—4.8kb。两末端各含一个ITR, 中间含有rep和cap基因。其中，ITR基因包含145个核糖核酸，前125个核糖核酸形成一个Y型或T型的回文结构，是病毒包装以及AAV基因组复制的重要功能片段。rep基因有所重叠，一共编码四个Rep蛋白，且其转录有两个不同的启动子控制。其中P5启动子控制转录的Rep78/68为病毒DNA复制、转录调控和特异位点整合所需。P19启动子控制转录的Rep52/40在病毒基因组包装过程中起着关键作用。Cap基因包含有P40启动子，通过不同的翻译起始子编码VP1、VP2、VP3，来组装成病毒的包装蛋白，很大程度上决定了病毒的血清型和对组织或细胞的嗜性。
长期以来，AAV被认为是一种缺损病毒，其复制必须依赖于辅助病毒如腺病毒或疱疹病毒的存在。但其进一步研究表明，AAV并非缺损病毒，只是在正常细胞中倾向建立潜伏感染，当细胞受到刺激时，如紫外照射的情况下也能在宿主细胞中产生感染性增殖。
AAV感染宿主细胞是一个有序过程。以AAV2型为例
1）与细胞表面受体结合。细胞表面受体一般包括主要受体和辅助受体。如针对AAV2型，细胞表面的主要受体为硫酸肝素糖蛋白（HSPG），辅助受体为-成纤维细胞生长因子受体(FGFR)或肝细胞生长因子受体（HGFR）、αVβ5整合素。
2)细胞内吞，形成包涵体。
3）转运进细胞核。
4）脱壳释放病毒基因组。
5）AAV基因组由单链DNA转变为双链DNA。双链DNA整合进宿主细胞DNA（人体内定点整合进19号染色体的q臂端）或以附加体的形式存在。当AAV基因组中携带目的基因且整合进19号染色体时，目的基因便可以持续表达，从而达到长期治疗的效果。
篇章三：如何更有效地提高AAV载体的靶向性？
**** Hidden Message *****手头资料比较多，但苦于暂时没有时间整理，先列一些自己本打算发中文综述时写的一些东西吧，请勿转载。
AAV 杂和载体的构建
1982年，Samulski首次构建出具有感染力的重组AAV载体。其后，在1984年，Hermonat带有新霉素抗性基因的AAV载体导入哺乳细胞，自此以后，AAV载体的应用得到了迅速的发展。这一阶段AAV载体的应用集中在AAV2型载体，但随着研究的深入，发现AAV2型载体对部分靶细胞和组织转导效率并不理想，同时由于人体内AAV2型中和抗体的普遍存在也阻碍了其进一步研究 。近十年的研究开始集中在人工构建靶向性AAV载体.其方法主要集中在两方面。其一是将AAV病毒颗粒与某一靶向分子或特异性抗体耦联,从而使得构建的载体改变嗜性，特别针对所有12种血清型均不能转导或效率很低的组织和细胞意义更显重大；另一种方法是改变AAV的cap基因编码的外壳蛋白构建AAV杂和载体从而改变其嗜性，同时也会降低由2型载体引起的中和抗体的免疫反应。后一种方法是目前研究的重点和热点，本文也将对此进行详述。
构建AAV杂和载体方法主要有两种。
其一是构建假型病毒载体。假型病毒载体是指cap基因和ITR基因不是来源于同一种血清型的AAV载体。基于嗜性主要由cap基因决定，以及目前对AAV2型的ITR和rep研究得比较清楚且较为稳定，所以目前构建的假型病毒载体主要是由AAV2型提供ITR基因，全部或部分的rep基因，而cap基因由其他血清型的AAV提供。
其二是构建AAV嵌合载体。
嵌合病毒载体是指新构建的载体的外壳蛋白是不同血清型的外壳蛋白组合而成。其类型主要有两种。
1）来源不同血清型的外壳蛋白亚基组装成新的嵌合载体的蛋白质外壳。按不同比例混合的辅助质粒能提供不同血清型不同比例的cap蛋白，通过cap蛋白的不同比例的组合从而形成具有特殊嗜性且具有一定转导效率的AAV嵌合载体。
2）在外壳蛋白的某位点插入外源蛋白。
A两个或多个AAV血清型的cap基因序列之间发生的同源重组，通过筛选后得到新的生物学特性的AAV载体。Bowles通过三种AAV2型突变体和AAV3之间进行cap基因重组得到新的AAV嵌合载体。
B在AAV 的cap基因的适宜位点插入特异性配体，从而得到新的嗜性或转导效率提高的AAV载体。Yang早在1998年就研究发现通过在VP2蛋白N末端插入CD34抗抗体的单链可变区来提高AAV载体在KG-1上的表达量。
C在AAV的cap基因的适宜位点插入随机序列，通过筛选得到目的载体。Muller在AAV2的cap基因位点的R588位点附近插入由7个随意氨基酸组成的肽段，通过筛选后得到能感染冠状动脉内皮细胞的AAV载体。
本帖最后由 晚风hit 于 2015-2-6 14:44 编辑
专题四：AAV的整合性与免疫原性
wtAAV因为Rep蛋白的存在而能实现在人第19号染色体上定点整合，但rAAV在构建的过程中本身就剔除了rep基因，以此消除rep蛋白对宿主细胞的影响，因此也就失去了定点整合的能力而转化为随机整合（可能会使有效基因失活，甚至致癌）。
另外大家对wtAAV定点整合的机制以及如何实现rAAV定点整合可参考我的附件～
免疫方面：产生的原因除了我们所熟知的病毒载体本身的外壳蛋白的原因外，目的基因本身产生的目的蛋白可能也会产生免疫效应。
文中列出目前采用的一些最常用的方法，其中我个人认为最重要的就是选择合适的血清型，以及如何在源头消除。（也就是分别在生产和纯化两个阶段消除Cap蛋白）
一只蜗牛：
对于楼主的问题，有两个讨论下
1. “⑸定点整合：如此避免了类似于腺病毒的随机整合”，在我所知道的知识里，没有听到有这个现象。之所以广泛使用腺病毒载体，一个很重要的原因就是腺病毒不会整合到宿主基因组中—安全。
2. “在高光坪教授的实验中的小鼠的肝脏在培养8年后仍能表达目的基因，这也在一个侧面说明了整合的存在性。”这个不能说明问题。第三代腺病毒载体（HD-Ad or gutless Ad），由于免疫原性低，可在小鼠体内存在两年而不被清除—相当于小鼠的寿命。但腺病毒并不整合。一直有表达，不代表就会整合进去，因果关系并不存在。
对Rojier的问题，我有一点了解和看法；
1. 病毒载体的嗜性广泛，以常用的腺病毒载体来说，CAR在很多细胞表面存在，因此能感染很多细胞，包括分裂和静止的细胞。而病毒良好的靶向性是针对非病毒载体来说的。有病毒受体的细胞才能被病毒载体感染，这个过程不是随机的。但还有一种更实用和方便的办法，是调控外源基因的表达，比如miRNA，特异性的启动子（如端粒酶启动子，或者Tetracycline-dependant regulatable gene expression systems）等。当然，这些调控的办法，也不是没有缺点，比如在关的状态漏表达等，这里就不详述了。因为病毒受体和配体已经天然存在，要修改，不那么容易。
补充一下，要改，也有办法。比如腺病毒，化学方式修改Fiber，在另外一端加上RGD序列或者别的配体，这样就能改变病毒本身的嗜性。也可以把常用的C组的2型或5型的Fiber换成B2组的35型的，这样，腺病毒能更倾向于感染DC细胞等抗原呈递细胞，在载体疫苗方面具有更广阔的应用前景。
另外，在实际过程里，病毒的嗜性也不是那么简单的。体内潜在的靶细胞是处于基质细胞，毛细血管，细胞外基质（ECM）的复杂立体包围中。病毒能否有效感染，感染后能否继续增值感染临近的靶细胞，都是一个值得探讨的问题。在实际过程中，似乎效率很低。
2.而改造病毒克服机体的载体免疫，碰巧我要做点这方面的工作，了解一些。我知道的有三种方法。病毒载体的免疫，根本原因就是病毒载体自身的蛋白，特别是免疫原性很强的外壳蛋白造成的。因此，只要抑制这些蛋白的产生或者免疫原性就能达到预期目的。一种是化学修饰或者突变，改变原来的免疫原性。这种方法能解决体内的先存载体抗体造成的问题。还有就是利用一种病毒有很多种不同的血清型。这样，做一种病原，换一种血清型，呵呵。比如腺病毒有50多种血清型。最后一种就是让病毒载体不复制，这样晚期蛋白量就会减少，这也是一种常用的策略。腺病毒三代载体都是复制缺陷型的，就是通过确实E1区（或进一步突变E2区的部分蛋白）来实现的。
手都打累了，电脑死机，重打了一次，最后补充一点，载体引起的免疫也不是没有作用，比如在做疫苗的时候，加强免疫活性，相当于佐剂嘛，呵呵。
不对之处，还望大家批评指正。
AAV FOR GENE TARGETING IN VIVO AND IN VITRO
利用AAV进行gene knockout 和gene knockin， 目前在细胞水平和动物水平（小鼠）均有报道，相关文章发表在nature protocol(doi:10.1038/nprot.2007.408)、nature hyh2000518
biotechnology(doi:10.1038/nbt1231) 等杂志上。2008年，相继有AAV介导的CFTR基因敲除猪和雪貂文章分别发表在 science 和JCI 上。
传统的同源重组质粒转染方法由于其效率低下，尤其在体细胞水平的效率尤其低（ES 细胞相对高些），制约了基因打靶技术的发展。而AAV介导的基因打靶技术，可提高20-30倍的效率。我想这也应该是AAV一个非常具有应用前景的方向。
所以我的研究方向就选择了利用AAV 进行体细胞基因打靶。
由于刚开始接触AAV，有关病毒包装的工作也没有接触过，采用什么样细胞包装、如何提高病毒滴度等等许多问题，希望在这里能得到高手的指点。
晚风hit
在2009年的一篇nature biotechnology上的文章的讨论中看到了有关其基因敲除方面的优势，当时就在想如何具体应用～幸得楼上做该方面研究，还请多多讨论交流！
页:
[1]