人杯状病毒的检测
一、ELISA检测人杯状病毒采用IDEIA™ Norovirus试剂盒（DakoCytomation公司），仅限于检测人杯状病毒中的诺如病毒（属）GⅠ和GⅡ型。（一）检测前准备工作1.粪便标本处理：加入1ml样品稀释液（sample diluent）至1.5ml EP管中，加入0.1g固体粪便标本或0.1ml液体粪便标本，置于漩涡震荡器混匀，室温静置10min，室温下≥5000rpm离心5min。2.阴性对照：将1ml样品稀释液（sample diluent）加至标记好的小瓶中作为阴性对照。3.阳性对照：1ml对照稀释液（control diluent）溶解阳性对照，使用前混匀。4.洗液的配制：1倍体积的洗液浓缩液，加9倍体积的去离子H2O。当天用当天配。（二）标本检测1. 将需要数量的微孔板置于微孔板架上。2. 每孔加入100µl 10％便悬液或阴性对照或阳性对照（每次检测均需加一个阳性对照和一个阴性对照），20～30℃静置60±5min。3. 每孔加入2滴（或100µl）酶结合物（conjugate），用枪头轻柔混匀。4. 每孔加入350µl洗液，洗5次，在卫生纸上拍干。5. 每孔加入2滴（或100µl）底物液（Substrate），20～30℃静置30min。待蓝色显现后迅速观察颜色。6. 每孔加入2滴（或100µl）终止液（Stop solution），充分混匀。7. 读取OD450值，打印输出或记录OD值。结果必须在加入终止液后30min内读取。(三) 检测结果的判定：1. 阴性对照：肉眼观察无色或OD450值<0.15。2. 临界值：OD450值＝阴性对照OD450值＋0.10。3. 阳性对照：肉眼观察呈现独特的蓝色或OD450值>0.50。4. 标本：肉眼观察蓝色比阴性对照颜色深判定为阳性，肉眼观察无色判定为阴性；或者OD450值大于临界值判定为阳性，小于临界值判定为阴性，OD450值在临界值±0.01范围内判定为可疑，应重复检测。（四）注意事项：1.打开后的96微孔板应置于可封口的有干燥剂的口袋中贮存于2～8℃，打开后6周内用完。2.终止液中含0.3mol/L硫酸，避免接触到皮肤和粘膜。如果终止液接触到这些部位立即用水冲洗。3.未用完的阳性对照可在2～8℃贮存1个月，长期贮存应分装存于-20℃。4.底物液避光保存，不要使用已经变蓝的底物液。5.避免污染。二、人杯状病毒RT-PCR检测可以同时检测出人杯状病毒中诺如病毒（属）和扎如病毒（属）。（一）病毒RNA提取：1．提取前的准备工作：（1） 将1ml Buffer AVL加入装有低压冻干的Carrier RNA中，彻底溶解Carrier RNA后，将溶有Carrier RNA的Buffer AVL转入至Buffer AVL瓶中，彻底混匀。分装贮存于2～8℃。如果在2～8℃时，Buffer AVL/Carrier RNA溶液形成沉淀，可在80℃重新溶解，注意加热的时间不能超过5min，用前冷却至室温。Buffer AVL/ Carrier RNA溶液不能加热超过6次。（2） 加入合适比例的96～100％的酒精至Buffer AW1中，19ml的Buffer AW1加入酒精25ml。（3） 加入合适比例的96～100％的酒精至Buffer AW2中，13ml的Buffer AW2加入酒精30ml。2．病毒RNA的提取：（1） 在1.5ml EP管中加入560µl 已加入Carrier RNA的Buffer AVL。（2） 将140µl 10％便悬液加入至EP管中的Buffer AVL中，vortex混匀15sec。（3） 室温（15～25℃）孵育10min。（4） 将1.5ml EP管轻微离心，以去除管内的液滴。（5） 在管内加入560µl 96～100％的酒精，vortex混匀15sec。混匀后，将1.5ml EP管轻微离心，以去除管内的液滴。（6） 小心的将630µl步骤5中的溶液加入至已放入至2ml收集管中的QIAamp离心柱中，注意不要弄湿柱子边缘。盖上盖子，8000rmp离心1min。将QIAamp离心柱放置至另一干净的2ml收集管中，弃去包含有滤过液的收集管。（7） 小心打开QIAamp离心柱的盖子，重复步骤6。（8） 小心打开QIAamp离心柱的盖子，加入500µl Buffer AW1。盖上盖子，8000rmp离心1min。将QIAamp离心柱放置至另一干净的2ml收集管中，弃去包含有滤过液的收集管。（9） 小心打开QIAamp离心柱的盖子，加入500µlBuffer AW2。盖上盖子，14,000rmp离心3min。弃去收集管中的滤过液，14,000rmp离心空柱子1min。（10）将QIAamp离心柱放置入干净的1.5ml离心管中。弃去包含有滤过液的收集管。小心打开QIAamp离心柱的盖子，加入60µl Buffer AVE至离心柱中，盖上盖子，室温孵育1min。8000rmp离心1min。（2×40µl的Buffer AVE洗脱两次，能增加产量。）病毒RNA进行反转录，或贮存于－20℃或－70℃备用。（二）人杯状病毒ssRNA的反转录：在0.2mlEP管中配制如下逆转录体系。10×缓冲液 2.5 µl25 mM MgCl2 4 µl2.5mM dNTPs 5µl1% BSA 2.5µl0.2 µg/ µl引物289混合液 1µl10 U/µl AMV-RT 0.35µl50 U/µl RNasin 0.1µlDEPC处理H2O 8.05µlRNA 1.5µl共25µl，混匀，轻微离心，42℃反转录1hr。（三）人杯状病毒cDNA PCR扩增在0.2ml EP管中配制如下PCR体系：10×缓冲液 5µl25mM MgCl2 4µl10mM dNTPs 1µl0.2 µg/ µl引物289混合液 1µl0.1µg/ µl引物290混合液 1µl5 U/µl Taq酶 0.4 µlDEPC处理H2O 29.6µlcDNA 8µl
共50µl，混匀，轻微离心，放入PCR仪中扩增，反应条件：94℃变性3min后，94℃ 60s，58℃1min20s，72℃1min，进行30个循环，72℃延伸10min。反应结束后1.5％琼脂糖凝胶电泳或4℃保存PCR产物。表1人杯状病毒RT-PCR所用的引物
引物位置方向核酸序列(5’–3’)
289H4865-4886-TGACGATTTCATCATCACCATC
289I4865-4886-TGACGATTTCATCATCCCCGTC
290H4568-4590+GATTACTCCAGGTGGGACTCCAC
290I4568-4590+GATTACTCCAGGTGGGACTCAAC
290J4568-4590+GATTACTCCAGGTGGGATTCAAC
290K4568-4590+GATTACTCCAGGTGGGATTCCAC
（四）检测结果的判定：取15µl RT-PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳。人杯状病毒诺如属扩增产物大小为319bp，扎如属扩增产物大小为331bp。（五）注意事项：1. 枪头避免触及QIAamp离心柱的滤过膜。2. 避免污染。应该戴手套进行操作。PCR实验室应该分为3个区：试剂准备区，样品准备区，扩增和检测区。3. EB可能致癌，必须小心操作，划定EB污染区。
感谢楼主分享。
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