细胞DNA定量分析__中国宫颈癌筛查技术的多元化
近50年来，宫颈癌筛查大大降低了发达国家和发达地区宫颈癌的发病率与死亡率，而在发展中国家以及经济欠发达等卫生资源缺乏的地区，宫颈癌的发病率与死亡率虽有所减低，但实际上仍比发达国家高许多，这可能与细胞学筛查技术本身的特点及应用国家的国情相关，尤其是TCT和LCT筛查技术的细胞病理学专家、细胞学筛查技术普及和TBS系统的应用等方面具有“不标准性、不确定性、不稳定性”的缺憾。为此，细胞DNA定量分析技术，对宫颈细胞的检测能实现检测技术的智能化、标准化、自动化，可弥补大面积多人群筛查依赖病理医生阅片的缺憾，解决目前我国细胞学检查遇到的困难。http://www.ivdchina.org/file/upload/201508/19/16-15-30-47-2469.jpg
据世界卫生组织2000年的数据，子宫颈癌是发病率仅次于乳腺癌的第2位恶性女性肿瘤，全球每年约46.6万新诊断子宫颈癌病例, 近27万人死于该病，其中82%的死亡病例是在发展中国家。我国每年新增子宫颈癌病例约13.15万, 占世界宫颈癌新发总数的1/3，约8万人死于此病。2008年的数据显示，在发达国家，宫颈癌的新发病例居于全身恶性肿瘤的第10位，而在发展中国家，宫颈癌的新发病例仍位于第二位。2012年的数据再次表明，宫颈癌发病率居女性恶性肿瘤的第二位，死亡率居恶性肿瘤第七位，WHO估计世界范围内的宫颈癌新发病例为52.8万，85%发生于经济欠发达地区。中国宫颈癌新发病例有所下降，达6.20万。
宫颈癌筛查虽然大大减少了发达国家和发达地区宫颈癌的发病率与死亡率，而在发展中国家以及经济欠发达等卫生资源缺乏的地区，宫颈癌的发病率与死亡率虽有所减低，但仍比发达国家高。在这些国家和地区，普遍存在着人口基数大、卫生资源短缺、病理医生缺乏，尤其是细胞病理学医生严重不足，加上经济基础和经费实力不够的情况，无疑放大了宫颈癌三阶梯筛查中第一阶梯细胞学筛查业已存在的问题：
①不少地区无奈仍沿用60年代制定的宫颈涂片巴氏染色；
②TCT/LCT检测结果假阴性率较高，容易漏诊早期宫颈癌；
③高倍镜下寻找细胞的重复性不好，且二次制片时，标本的细胞量渐减；
④AS-CUS和AGS性质未定者，需随诊而易失访；
⑤细胞病理学诊断医生奇缺，工作多由组织病理医师代替，甚至不少医院由体弱多病的妇产科医师、护士或检验员弥补来完成工作量；
⑥缺乏常态化学习TBS分类法系统的培训机构，细胞病理检验师没有考核准入制；
⑦检测机构缺乏定期质控及审核检查机制。
诸多因素导致我国宫颈癌筛查工作的第一阶梯细胞学检查不确定性、不稳定性、不标准性。于是为解决病理医师缺乏以及水平低下的问题，一些地区不得不放弃细胞学检查，而重新采用宫颈醋酸白染色（VLI）以及宫颈卢戈氏碘染色（VILI）作为宫颈癌的初筛。基于肉眼观察的宫颈癌筛查技术虽能解决上述问题的现状，并筛出一些病例，但是检出率低。Huchko MJ等在2007年到2010年对肯尼亚农村地区进行的筛查显示，VIA的敏感性仅为35.2%，VIA/VILI的敏感性为38.2%。Zhao等汇总了17年间的各项研究，结果显示，肉眼筛查的敏感性仅为54.6%。
鉴于有癌变趋势或者已经癌变的细胞核酸异常增生（含量增加），核酸改变早于细胞形态改变，定量分析细胞里面DNA核酸是否改变和改变多少可以直接、简单、准确判断细胞是否癌变等原理，在三阶梯筛查的基础上提出一种全新的找肿瘤细胞的方法——宫颈细胞DNA定量分析。希望能够找到一种自动化、智能化、标准化、且能够进行大规模筛查的客观筛查技术，克服目前宫颈癌第一阶梯筛查依赖病理医生阅片的困难。
1、细胞分裂增殖生长周期
1953年霍华德(Howard)和培雷克(Pek)率先提出了细胞周期(cell cycle)概念，它构成了细胞学说的重要组成部分。细胞由一次分裂结束到下一次分裂结束，都要经历相同的变化阶段(即G1→S→G2→M )周而复始地进行活动，细胞的这种生长、分裂循环即称为细胞周期(cell cyc1e)。一个细胞周期包括有丝分裂期(M)和分裂间期(G1、S、G2)。尽管在各种细胞中各期所占时间都不尽相同，但相对而言M期最短，S期却较长。细胞周期普遍存在于动植物细胞中，正常和异常细胞增殖过程中。
大多数细胞在G0、G1期，即染色体对数为23对，又称为DNA二倍体（2c细胞）。少数细胞在S期（染色体对数在23对至46对之间）、G2期（染色体为46对，4倍体细胞或4c细胞）和M期（46对染色体到23对染色体）。在正常人体细胞中， DNA含量是一致的，即为整倍体。只有以下三种情况才出现非整倍体细胞：生殖细胞; S期细胞，DNA含量在2倍体和4倍体之间，一般细胞很少；某些丢失了DNA片段的退变细胞。
细胞周期各时相中有各自特异性的调控因子控制细胞周期有序地进行。美国的Leland Hartwell发现了在细胞周期的最初阶段起调控作用的“START”基因，还引入了“检测点（checkpoint）”这一概念，对于理解细胞周期很有帮助。英国的Paul Nurse运用遗传学和分子生物学方法首次鉴定、克隆出细胞周期的关键调控子之CDK分子（周期素依赖性激酶），同时还发现CDK在进化中高度保守，它可使其他蛋白质磷酸化，从而使细胞沿着细胞周期不断地进行分裂。英国的Tim Hunt发现了作为CDK调控分子的周期素(cyclin)。Hunt在研究中发现，周期素在每次细胞分裂过程中均发生周期性的降解，后来证明这是细胞周期调控的一种普遍性的重要机制。三位科学家也因为“发现了调节所有真核有机体细胞周期的关键因子”荣获了2001年诺贝尔生理学或医学奖。
2、细胞DNA定量分析技术
细胞DNA定量分析技术主要通过对细胞核内DNA含量或倍体的测定来判断细胞的生理状态和病理改变，目前主要是使用全自动DNA图像分析系统（DNA-ICM）, 对细胞DNA进行定量分析时，具有如下特点：
①检测细胞核内的相对DNA含量。23对染色体约为7.18pg，但细胞DNA定量分析技术是检测细胞核内的相对DNA含量，而不是绝对值。在细胞DNA定量分析中，常用c（content）作为单位来衡量DNA的含量。1个c为正常G0/G1细胞DNA含量的一半，故G0/G1细胞为2c细胞（2倍体细胞），而G2/细胞为4c细胞（4倍体细胞）。
②Feulgen染色使DNA特异性着色。Feulgen染色由Feulgen和Rossenbeck在1924年发现的一种细胞核内DNA染色技术。染色原理是Schiff试剂（品红醛试剂，由碱性品红和亚硫酸钠配制而成）可以和酸化水解后DNA上的醛基相结合而显色。其染色的深浅与DNA的含量成正比。
③通过测量光密度（灰阶）计算被测细胞细胞核的积分光密度值(IOD, integrated optical density)。当被测细胞处于G0/G1期时，其IOD量与正常细胞IOD平均值很接近。
④用DNA指数来表示DNA含量。DNA指数=被测细胞DNA IOD值/正常细胞DNA IOD平均值。由于DNA含量是对二维结构测定的，它不完全反映染色体的倍数，故用DNA指数来表示DNA含量。当被测细胞处于G0/G1期时，其IOD量与正常细胞IOD平均值很接近，故DNA指数为1，即为2c。同理，处于S期的细胞，DNA指数在1~2之间，即2c~4c之间。
⑤同一标本的淋巴细胞作为标准对照。由于淋巴细胞内DNA含量及形态较为稳定，很多DNA定量细胞学测定淋巴细胞的IOD, 将淋巴细胞DNA作为正常细胞DNA的参照来比较被测细胞的DNA。
⑥分析每个细胞的DNA含量，并用DNA直方图，散点图显示标本恶性度。DNA定量分析能够对检测的每个细胞的DNA含量进行定量分析，且按细胞DNA含量高低，由高到低自动排序，将核酸含量高的前20个细胞核酸含量值直接报告，高于正常值为癌变细胞。对宫颈细胞的检测实现智能化、标准化、自动化，无需依赖病理医生的阅片，能有效弥补细胞学检查的“三不特性”。（如图1）
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图1：细胞DNA倍体分析报告图
3. 细胞DNA定量分析技术在宫颈癌筛查中的应用
宫颈细胞的恶变由胞核染色质首先改变，高危型HPV的DNA整合到宫颈细胞核DNA上，病毒蛋白E6/E7分别通过与抑癌蛋白P53、RB相作用，干扰中心体合成，纺锤丝缺陷，出现异倍体细胞核，最终才发展到晚期癌变细胞。这是细胞DNA定量分析技术可用于宫颈癌筛查的理论依据，也是全自动DNA图像分析系统在诊断CIN病变有可能较常规细胞学敏感的理论基础。
孙小蓉等于2001到2004年使用细胞DNA倍体分析技术对武汉郊区农民进行宫颈癌筛查，结果显示，经常规细胞学诊断为宫颈癌和HSIL的病例中, 分别有88%和84%的病例出现异倍体细胞或异倍体细胞峰。而只有53%的 LSIL病例、18%的 ASCUS病例发现有DNA异培体细胞或异倍体细胞峰。同期开始至2010年，使用细胞DNA定量分析技术对武汉市汉南区妇女进行为期10年的宫颈癌筛查情况如下：宫颈癌筛查总人数:16660人，普及82%育龄妇女，建议做活检仅3.4 %；坚持10年筛查，近4年，该区无一例妇女死于宫颈癌。筛查结果还显示，异倍体细胞数与TBS法检查提示的细胞病变程度呈正比。（如图2）。
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图2：细胞DNA倍体分析与TBS结果的一致性
Mei JH等对8448位就诊患者同时进行自动细胞DNA倍体分析和TCT检测，将ASCUS与1 - 2异常DNA倍性细胞和≥3异常DNA倍性细胞进行比较，认为前者无统计学意义，而后者有统计学意义，且≥3异常DNA倍性细胞的检出率随着TCT检测级别上升而升高，ASCUS中检出率39.9%，ASC-H中检出率75.6%，LSIL中检出率76.4%，HSIL中检出率95.5%。李华等对4562名妇女用宫颈刷取材, 每例液基薄层制片2张,1张巴氏染色做TBS细胞学检查,1张Feulgan染色, 用全自动DNA倍体分析系统做DNA定量分析。结果显示巴氏细胞学诊断CIN2及CIN2以上级别病变的敏感度为60%,特异性为89%。若将超过3个5C细胞定为筛查后需做活检标准,DNA定量分析系统诊断CIN2及CIN2以上级别病变的的敏感度为76%,特异性为86%，认为DNA定量分析方法在有条件的降低特异性的情况下,能明显提高宫颈癌早期筛查的阳性检出率，较常规细胞学更适合用于大规模早期宫颈癌的筛查。林丹等对502例宫颈癌筛查患者同时行宫颈液基细胞学检查（TCT）、细胞DNA倍体分析及高危HPV检测，结果显示，DNA倍体分析对CIN2+病变的敏感度为78.26％, 特异度为90.93％; DNA倍体分析联合高危型HPV检测对CINⅡ+的敏感度可达91.30％,特异度可达92.19％，认为DNA倍体分析联合高危型HPV检测是筛查CINⅡ+病变的有效方法,有一定的临床应用价值,尤其适合在医疗资源缺乏的地区实施。
4、细胞DNA定量分析技术在非宫颈细胞学临床诊断中的应用
细胞DNA定量分析技术主要的临床应用可分为两大类，一是脱落细胞类，二是组织印片类。前者标本除了宫颈脱落细胞外，还可以是浆膜腔积液（胸腹水）、支气管刷及灌洗液、痰、鼻（喉）腔组织刷片、宫颈脱落细胞、尿液等，后者如乳腺组织印片、刮宫绒毛组织、鼻腔肿物组织印片、皮肤肿物印片、肺组织印片、鼻（喉）腔组织印片、胃肠道等组织印片等等。细胞DNA定量分析的临床应用范围十分广泛。
Kmmerer PW等对70位患者的88份口腔脱落细胞同时进行细胞学和细胞DNA定量分析，结果显示，细胞DNA分析技术检测口腔鳞状上皮不典型增生Ⅰ级（SIN Ⅰ）及以上病变具有70%的敏感性和100%的特异性，与细胞学检查合用，敏感性可达76%。Meng Z等对126例的积液标本同时进行细胞学与DNA倍体分析，认为取DNA含量大于2.5c的细胞数超过4个为异常时，可获得最佳的cut-off值，诊断恶性积液的敏感度可达88.3%，特异性可达100%，从而认为DAN倍体分析不失为一种简单、经济实用的区分良恶性积液或排液的有效方法。
为解决细胞学筛查技术诸多不确定因素，目前宫颈癌的初筛方案有单用细胞学、细胞学联合HPV分型检测和单独HPV分型/不分型检测。再根据行阴道镜之前加或不加分流检测、以及是否仅采取HPV 16/18的分型检测构成了约10种的宫颈癌筛查策略。就我国的基本国情，东部、沿海发达地区与内陆、西部经济欠发达地区在卫生资源、医疗资源方面的差异，应该倡导中国宫颈病变筛查的多元化，但是仍然需要有一个方向，即更有效、更经济、更简便。正常女性HPV检测的阳性率超过10%，感染过HPV的人群实际发展成宫颈癌的仅为1/5000~7000，若以HPV检测作为宫颈癌的一线筛查，可能会引用部分正常人群的恐慌，增加就诊次数、加重各级卫生机构工作量，浪费已经紧张的医疗资源，更糟糕的是增加了患者的心理和经济负担。目前HPV检测的费用较贵，这也是国内部分妇产科医师不主张将HPV检测单独作为宫颈癌初筛的原因。鉴于细胞DNA自动检测技术可量化诊断、重复性好、标准质控、操作简单，以及全自动化的五大优势，能有效弥补人工细胞病理阅片主观性强、重复性差、质控困难、工作量大，以及缺读片员的五大缺陷，可考虑将细胞DNA定量分析与TBS诊断互补，辅助妇科医生临床诊治。（见表1）
表1：TCT结合DAN定量分析临床指导意义
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在病理细胞学医师缺乏的地区，可考虑结合细胞DNA定量分析和HPV检测，作为大面积多人群宫颈癌一线筛查的技术。（如图3所示）
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图3：细胞DNA定量分析和HPV结合的筛查方案
或者将细胞DNA倍体单独作为一线筛查，其结果及临床参考意义如表2。
表2：DNA倍体分析结果及临床意义
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将宫颈细胞DNA倍体分析取代或联合液基薄层制片（TCT）作为宫颈癌一线筛查方案，已经有不少省市的筛查中心开始采用。相信在未来我国的宫颈癌细胞DNA倍体检测应用过程中，该技术和TCT可同时作为筛查及分流诊治的手段。期待着我国妇产科专家和细胞病理学专家拿出更多的临床循证医学的证据。
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