本指导原则旨在指导注册申请人对丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）核糖核酸(ribonucleic acid, RNA)测定试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。
本指导原则是对丙型肝炎病毒核糖核酸测定试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。如申请人认为有必要增加本指导原则未包含的研究内容，可自行补充。
本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。
一、范围
（一）临床背景
丙型肝炎是一种主要经血液传播的疾病，丙型肝炎病毒慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌，对患者的健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题。
（二）丙型肝炎感染分布
丙型肝炎呈全球性流行，是欧美及日本等国家终末期肝病的最主要原因。据世界卫生组织统计（2014），全球约1.85亿人感染HCV，其中约1.5亿为慢性感染，每年有35万～50万人死于丙肝并发症，每年新发感染病例约300万～400万例。
HCV1b和2a基因型在我国较为常见，其中以1b型为主；某些地区有1a、2b和3b型报道；6型主要见于香港和澳门地区，在南方边境省份也可见此基因型。
（三）HCV特点
HCV属于黄病毒科(flaviviridae)，其基因组为单股正链RNA，易变异，目前可分为6个基因型及50多种不同亚型，按照国际通行的方法，以阿拉伯数字表示HCV基因型，以小写的英文字母表示基因亚型(如1a、2b、3c等)。基因1型呈全球性分布，占所有HCV感染的70％以上。
HCV基因组含有一个开放读框(open reading frame,ORF)，编码10余种结构和非结构(NS)蛋白，NS3蛋白是一种多功能蛋白，氨基端具有蛋白酶活性，羧基端具有螺旋酶/三磷酸核苷酶活性；NS5B蛋白是RNA依赖的RNA聚合酶，为HCV复制所必需，是抗病毒治疗的重要靶位，其末端具有核苷酸转移酶活性，但由于RNA酶缺乏矫正功能不能修正错配，多次复制后易导致HCV多种变异产生。
（四）HCV RNA定量检测
HCV RNA定量检测方法包括实时荧光逆转录聚合酶链反应(qRT-polymerase chain reaction，qRT-PCR)、分枝DNA(bDNA)等。本指导原则所指的HCV RNA测定试剂是指利用qRT-PCR方法的核酸检测技术，以HCV基因序列为检测靶标，对人血清、血浆及其他人体样本中的HCV RNA进行体外定量检测的试剂，可作为HCV现症感染的证据和抗病毒疗效评估的观察指标。
其他类同用途的核酸定量检测方法可参照本指导原则，但应根据产品特性确定其中具体内容是否适用，如不适用，应另行选择符合自身方法学特性的技术要求或评价方法。本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。
本指导原则不适用于按照药品管理的用于血源筛查用途的HCV RNA检测试剂。
二、基本要求
（一）综述资料
综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、有关产品主要研究结果的总结和评价以及其他等内容，其中其他包括同类产品在国内外批准上市的情况，应着重从方法学及检出限等方面写明拟申报产品与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。应符合《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号）和《体外诊断试剂注册申报资料要求及说明》（国家食品药品监督管理总局公告2014年第44号）的相关要求。
（二）主要原材料的研究资料
应提供主要原材料如引物、探针、酶、标准品或企业参考品等的选择与来源、制备过程、质量分析和质控标准等的相关研究资料。如主要原材料为企业自己生产，其生产工艺应稳定；如主要原材料源于外购，应提供的资料包括：选择该原材料的依据及对比试验资料、供货方提供的质量标准、出厂检定报告，以及该原材料到货后的质量检验资料。主要原材料的研究资料如下：
1.企业内部参考品:应详细说明有关企业内部参考品的原料选择、制备、定值过程等试验资料。建议优先选择不同型别的临床阳性样本制备内部参考品以直接反映临床实际情况并起到质控的作用；企业也可选择假病毒如蛋白包裹RNA（armored RNA）作为内部参考品，假病毒的优点是易制备、型别全且无生物安全性风险，但不像临床样本可以完整反应实际的检测效能。建议企业内部参考品应覆盖1～6型，其中至少包括1、2、3型别的临床阳性样本，各型别参考品在同一浓度水平应有多份。
阳性参考品：每个型别设置三个梯度并尽量覆盖线性范围，阳性参考品的亚型以及浓度需经过可靠方法进行确认。
阴性参考品：可采用经确认无HCV感染的临床样本，还应考虑纳入其他近似病原体（乙型肝炎病毒，hepatitis B virus，HBV；人类免疫缺陷病毒，human immunodeficiency virus，HIV等）感染样本。
检测限参考品：检测限参考品的原料要求参考阳性参考品。在进行最低检测限性能评估时，应设置多个梯度，从扩增反应终体系核酸浓度进行评价，建议采用95%（n≥20）的阳性检出率作为最低检测限确定的标准。当设置检测限参考品时，可以仅设置一个浓度水平，该水平可略高于95%的阳性检出率水平，而设置为100%检出，应明确参考品中靶核酸的浓度水平。
精密度参考品：精密度参考品原料要求同阳性参考品，应对弱阳性、中或强阳性水平的精密度进行验证；如有必要，建议同时设置阴性参考品对精密度进行验证。
2.试剂盒内对照品（质控品）
试剂盒的质控体系通过设置各种试剂盒对照品来实现，质控体系需考虑对样本核酸分离/纯化、配液及加样、试剂及仪器性能、扩增反应抑制物（管内抑制）、交叉污染、靶核酸降解等因素可能造成的假阴性或假阳性结果进行合理的质量控制。对照品可采用人血清（血浆）或假病毒进行配制。申报资料应对试剂盒对照品有关原料选择、制备、定值过程等试验资料详细说明。HCV RNA定量检测试剂的质控品应至少设置三个量级水平的系列质控品:弱阳性质控品、强阳性质控品和阴性质控品。校准品和质控品均应参与样本核酸的平行提取，以对整个PCR反应过程、试剂/设备、交叉污染等环节进行合理质量控制。企业应对各质控品的浓度范围作出明确的范围要求。
试剂盒质控体系主要考虑以下几方面：
阳性对照品（质控品）
建议对每次检测样品反应管设置强阳性对照品（质控品）及弱阳性对照品，阳性对照品应参与样本核酸的平行提取，以对样本核酸分离/纯化、试剂及仪器性能、扩增反应过程等环节进行质量控制，企业应对各阳性对照品（质控品）的浓度范围做出明确要求。如，可采用阴性人血浆+假病毒制备，应使用权威方法确认阴性人血浆的生物安全性及无干扰性：抗-HCV、抗-HIV 1/2、HBsAg等检测阴性，HCV RNA等检测阴性。
阴性对照（质控品）：
建议对每次检测样品反应管设置阴性对照（质控品），阴性对照品应参与样本核酸的平行提取,以对可能存在的交叉污染产生的假阳性结果进行质控。可采用阴性人血浆制备，应使用权威方法确认阴性人血浆的生物安全性及无干扰性，
3.校准品：基质应采用人血清或血浆，并能溯源至国际/国家标准物质，单位应使用IU/ml表示。提交完整溯源性文件，可参照GB/T 21415-2008《体外诊断医疗器械 生物样品中量的测量 校准品和控制物质赋值的计量学溯源性》进行。
4.核酸分离/纯化组分（如有）的主要组成、原理介绍及相关的验证资料。
5.聚合酶链反应（PCR）组分的主要材料（包括引物、探针、内标、各种酶及其他主要原料）的选择、制备、质量标准及实验研究资料，主要包括以下内容：
5.1脱氧三磷酸核苷（dNTP）
核酸的组成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP、dTTP，对纯度、浓度、保存稳定性等的详细验证资料。
5.2引物
由一定数量的dNTP构成的特定序列，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化，如为自制，应包括对序列准确性、纯度、稳定性、功能性实验等方面的验证。如为外购，应提供合成机构出具的包括如上性能的质检证明，如聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）结果或高效液相色谱法（HPLC）分析图谱。
5.3探针
特定的带有示踪物（标记物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能与互补核酸序列退火杂交，用于特定核酸序列的探测。合成后经PAEG或其他适宜方法纯化，在5'-端标记荧光素报告基团或其他发光标记物，在3'-端标记荧光素淬灭基团，并经HPLC或其他适宜方法纯化,纯度应达到高效液相色谱纯。如为外购，应提供合成机构出具的合成产物的质检证明(HPLC分析图谱)；应对探针的核酸序列及标记的荧光素或化学发光物进行核实，并作HPLC分析。
5.4 RT-PCR反应所需酶
通常包括以下几种活性：①RNA依赖的DNA聚合酶活性: 以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。②核糖核酸酶H（RNase H）活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNase H从RNA 5'端水解掉RNA分子。③DNA依赖的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。④热稳定性。
为了减少过程中产物污染，建议试剂盒组成体系增加降解反应产物的体系，如尿嘧啶糖基化酶（UNG）等，应对酶活性有合理验证，应提供有关保存稳定性、活性及功能性实验等的研究资料。
6.内对照（内标）的原料选择、制备、定值过程及试验资料。申请人应对内标的引物、探针和模板的浓度做精确验证， 内标设置应合理，内标值应在一定范围内设定上下限范围且阈值循环数（Ct）值不受靶序列的明显影响；通常选择假病毒,因不能反映提取问题，内标不应使用裸露RNA。
（三）主要工艺及反应体系的研究资料
基本生产工艺主要包括：配制工作液、半成品检定、分装和包装。配制工作液的各种原材料及其配比应符合要求，原材料应混合均匀，配制过程应对pH、电导率等关键参数进行有效控制。
生产工艺研究的资料应能对反应体系涉及到的基本内容，如样本类型、样本用量、试剂用量、反应条件、校准方法、质控方法、稳定性和有效期提供确切的依据，主要包括以下内容：
1.主要生产工艺介绍，应用流程图方式表示，并标明关键工艺质控步骤。
2.反应原理介绍。
3.基因位点选择、PCR方法学特性介绍。
4.确定最佳PCR反应体系的研究资料，包括酶浓度、引物/探针浓度、dNTP浓度、阳离子浓度、样本量、加样量及反应体积等，加样量和反应体积参考相应行业标准，经研究验证后确定。
5.确定PCR各阶段温度、时间及循环数的研究资料。
6.对于基线阈值（threshold）和Ct值确定的研究资料。
7.不同适用机型的反应条件的对比分析，如果有差异应分别详述，并提供验证资料证明差异性对试验结果的影响。
（四）分析性能评估资料
申请人应提交生产者在产品研制后，在实际生产条件下连续生产三批并对试剂盒进行的所有性能验证的研究资料，对于每项分析性能的评价都应包括具体研究目的、实验设计、研究方法、可接受标准、实验数据、统计方法等详细资料。有关分析性能验证的背景信息也应在申报资料中有所体现，包括实验地点（实验室）、适用仪器、试剂规格、批号、临床样本来源（如涉及）等。分析性能评价的实验方法可以参考相关的美国临床实验室标准化协会批准指南（CLSI-EP）文件或国内有关体外诊断产品性能评估的指导原则进行。对于HCV RNA测定试剂，建议着重对以下分析性能进行研究：
1. HCV RNA提取纯化
由于RNA酶的广泛存在，血样的保存运输以及RNA的提取纯化均应注意避免RNA酶的污染。
病毒RNA提取主要有以下目的：富集目的基因浓度、保证目的基因序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，是决定PCR成败的关键环节。因此，无论申报产品是否含有RNA分离/纯化的组分，企业都应对核酸提取的环节做详细的验证。临床标本中可能含有各式各样的PCR抑制物，因此，对于RNA提取试剂的选择，除最大量分离出目的RNA外，还应有纯化步骤（如磁珠提取法），尽可能去除PCR抑制物，避免使用无纯化步骤的简易方法。
申请人应结合申报产品的特性，合理选择优化RNA分离/纯化试剂，建议包含纯化步骤且内标、校准品、质控品均应全程参与提取纯化，并提供详细的验证资料：应至少包括提取效率、重复性和抗干扰研究。
2.最低检出限与定量限
2.1最低检出限与定量限的确定
建议使用国际参考品/国家参考品进行梯度稀释并多次检测，将具有95%阳性检出率的病毒水平作为最低检出限。至少应不高于国家参考品最低检出限50IU/ml的要求，根据循证医学中有关对HCV感染者进行抗病毒治疗效果及预后评估的需要，企业可根据自身产品性能情况和临床诊疗指南设定检测下限以符合临床需求。定量限应高于或等于检出限，将多次（至少20次）测量的结果符合试剂准确度要求的最低病毒水平作为定量限。
血清、血浆应分别进行最低检测限的验证。
2.2最低检出限和定量限的验证
申报试剂应在最低检出限或接近最低检出限的丙型肝炎病毒浓度进行验证，总测试数不少于60次。定量限的验证应总测试数不少于40次。
企业应能够提供用于最低检出限/定量限验证的病毒株的来源（1、2、3型）、型别确认及滴度确认试验等信息。
3.线性范围
线性范围确定的研究可使用高值临床样本（由可溯源至国家参考品/国际参考品的方法定量）或假病毒进行梯度稀释，稀释液应使用经确认为阴性的混合人血清或血浆，包含不少于9个浓度（应包含接近最低检测限的临界值浓度），使用至少3个批次的试剂进行试验。通过评价一定范围内的线性关系及各水平的准确度确定该产品的线性范围，评价的基因型别至少应包括1、2、3型。
4.准确度
对测量准确度的评价依次包括：与国家参考品（和/或国际参考品）的比对研究、回收实验、方法学比对等方法，企业可根据实际情况选择以下方法的一项或几项进行研究。
4.1国家/国际参考品验证
此类检测试剂有相应的国家/国际参考品，应使用国家/国际参考品对试剂进行验证，重点观察对相应参考品检测结果的符合情况。
4.2回收试验。用于评估定量检测方法准确测定加入国家/国际参考品的能力，结果用回收率表示。通常对样本进行3～5次回收试验，取平均值即平均回收率。
回收试验注意事项：
4.2.1加入的标准液体积一般应小于样本体积的10%；
4.2.2尽量使加入标准液后样本中的被测物浓度接近医学决定水平；
4.2.3标准物的浓度应该足够高，以得到不同浓度的回收样本；
4.2.4注意基质效应，尽量采用与临床待测样本一致的基质。
4.3方法学比对
采用参考方法或国内/国际普遍认为质量较好的同类试剂作为对比方法，与拟申报试剂同时检测一批病人样品，从测定结果间的相关性了解拟申报试剂与参比方法间的一致情况。如显著相关，说明两检测系统对病人标本测定结果基本相符，对同一份临床样本的医学解释，两检测系统不会产生显著差异结果。
实施方法学比对前，应分别对拟申报试剂和对比试剂进行初步评估，只有在确认两者都分别符合各自相关的质量标准后方可进行比对试验。方法学比对时应注意质量控制、考虑样本类型、浓度分布范围等并对结果进行合理的统计学分析（如，报告斜率和截距的95%置信区间）。
5.精密度
测量精密度的评价方法并无统一的标准可依，可根据不同产品特征或企业的研究习惯进行，前提是必须保证研究的科学合理性，具体实验方法可以参考相关的美国临床实验室标准化协会批准指南（CLSI-EP）或国内有关体外诊断产品性能评估的文件进行。企业应对每项精密度指标的评价标准做出合理要求，如标准差或变异系数的范围等。针对本类产品的精密度评价主要包括以下要求：
5.1对可能影响检测精密度的主要变量进行验证，除申报试剂（包括提取组分和聚合酶链反应组分）本身的影响外，还应对PCR分析仪、操作者、地点等要素进行相关的验证。
5.2合理的精密度评价周期，例如：为期至少20天的连续检测，每天至少由2人完成不少于2次的完整检测，从而对批内/批间、日内/日间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。如有条件，申请人应选择不同的实验室进行重复实验以对室间精密度进行评价。
5.3用于精密度评价的质控品应至少包括两个水平:
5.3.1弱阳性质控品：待测物浓度呈弱阳性（高于定量限浓度1个数量级），阳性检出率为100%且变异系数（CV）符合标准要求（n≥20）。
5.3.2强阳性质控品：待测物浓度呈中度至强阳性，阳性检出率为100%且CV符合标准要求（n≥20）。
6.HCV不同基因型的覆盖：
应至少对最低检测限和线性范围的评估覆盖全部申报基因型，至少包括1、2、3型。
7.特异性
7.1交叉反应
7.1.1用于HCV RNA检测试剂交叉反应验证的病原体种类主要考虑以下几方面可能性：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状（推荐种类见表1）。
7.1.2建议在病毒和细菌感染的医学相关水平进行交叉反应的验证。通常，细菌感染的水平为106 cfu/ml或更高，病毒为105 pfu/ml或更高。
7.1.3申请人应提供所有用于交叉反应验证的病毒和细菌的来源、种属/型别和浓度确认等试验资料。有关交叉反应验证的信息应以列表的方式在产品说明书的【产品性能指标】项中有所体现。
表1 用于交叉反应研究的微生物（推荐）
微生物 |
黄病毒科（如：西尼罗病毒等） |
登革热病毒 |
人巨细胞病毒 |
E-B病毒 |
人类免疫缺陷病毒1、2 |
乙型肝炎病毒 |
甲型肝炎病毒 |
梅毒螺旋体 |
人类疱疹病毒6型 |
单纯疱疹病毒1型 |
单纯疱疹病毒2型 |
甲型流感病毒 |
金黄色葡萄球菌 |
白色念珠菌 |
7.2干扰物质
7.2.1潜在的干扰物质主要包括：内源性物质（见表2）和常用的治疗药物如普通干扰素IFN-α、复合IFN和聚乙二醇干扰素α、利巴韦林、粒细胞刺激因子（GMCSF）等，应采用已报道峰浓度的几倍药物浓度进行验证。
7.2.2使用医学相关水平的干扰物浓度进行验证，另外，亦建议申请人在每种干扰物质的潜在最大浓度(最差条件)条件下进行评价。对于常见药物干扰试验，建议参照相应药物药代动力学研究确定的治疗药物浓度添加相应药物进行干扰验证。
7.2.3建议在病毒的检测临界值水平对每种干扰物质的干扰影响进行检测。
表2 建议用于干扰研究的物质（推荐）
干扰物质 |
胆红素* |
游离血红蛋白* |
甘油三酯* |
系统性红斑狼疮患者血 |
抗核抗体 |
类风湿因子 |
总G型免疫球蛋白（IgG） |
*为必须验证的干扰物质。
7.2.4使用HCV RNA阴性样本（血清、血浆）进行评估，评估试剂的特异性。
8.其他需注意问题
对于适用多个机型的产品，应提供如产品说明书【适用机型】项中所列的所有型号仪器的性能评估资料。如适用于不同样本类型，应提交对不同样本类型一致性的验证，包括不同抗凝剂的采血管的验证。
（五）稳定性研究资料
稳定性研究资料主要涉及两部分内容，申报试剂的稳定性和适用样本的稳定性研究。前者主要包括实时稳定性（有效期）、运输稳定性、开瓶稳定性及冻融次数限制等研究，申请人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据以及结论。对于实时稳定性研究，应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。
应对样本稳定性进行研究，主要包括对不同样本类型（血清、血浆）室温保存、冷藏和冷冻条件下的有效期验证，可以在合理的温度范围内选择温度点（温度范围），每间隔一定的时间段即对储存样本进行全性能的分析验证，从而确认不同类型样本的效期稳定性。适于冷冻保存的样本还应对冻融次数进行评价。
试剂稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果均应在说明书【储存条件及有效期】和【样本要求】两项中进行详细说明。
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