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标题: 【专题讨论】各种细胞传代培养的方法&操作 [打印本页]

作者: hantavirus    时间: 2016-2-16 16:54
标题: 【专题讨论】各种细胞传代培养的方法&操作
细胞培养对于病毒学实验至关重要。

    传代是细胞培养中的重要内容之一,常常有人问及某某细胞传代时选择何种消化酶(及其浓度)、消化时间和具体的操作步骤,所以很有必要在这方面做些总结,以利于坛友(尤其是细胞培养新手)能够方便地查到相关资料。

    现特设本专题,请高手们积极参与讨论,对于提供详细细胞特性、培养方法、操作步骤的,斑竹将给予金币或学分奖励。

要求:希望能够提供本人亲自实施过的、可行的传代方法、步骤以及培养条件(培养时有什么特殊要求也请一并指出),切忌单纯Copy甚至发布道听途说的“方法”!
作者: hantavirus    时间: 2016-2-16 16:56
本帖最后由 hantavirus 于 2016-2-16 16:58 编辑

抛砖引玉:养BHK-21细胞的经验:(转自wwwkkk83)

BHK-21细胞特性:

是幼年叙利亚地鼠肾细胞(Baby Hamster Syrian Kidney )。1961 年3 月,I.A. Macpherson 和 M.G.P. Stoker 从一日龄叙利亚地鼠肾分离建株,经过84 天连续培养,获得单细胞克隆细胞,即clone 13 或C13。BHK21 细胞广泛用于增殖各种病毒,已成为制备口蹄疫疫苗所需病毒抗原的理想细胞培养系,应用于口蹄疫疫苗生产,之外还可用于生产狂犬疫苗等其它兽用疫苗。BHK21 细胞染色体分布频率是n=44,为异双倍体细胞系,4 倍体发生率为4%,大多数细胞核型分析为44,XY,-6,-15,6q+,15q+。原始的BHK21 细胞株为成纤维细胞,属于贴壁依赖性细胞,后经无数次传代后细胞可悬浮生长。

传代方法:
除去旧的培养液后(吸得越干净越好)---用PBS缓冲液(或hanks)冲洗一遍----用1毫升0.22%的胰酶(0.02的EDTA)消化;(37度液消化约1-2分钟左右可以看到细胞像沙子一样脱落)——赶紧倒掉胰酶加入5ml左右 含10%的牛血清培养液终止消化,轻轻吹打下,细胞就全部脱落 分散。

   如果细胞长得太老,可以先加入1ml胰酶在细胞表面浸润一下就吸出来,然后再加入1ml胰酶消化。
胰酶在使用前预热到37度。
    消化时间的选择要根据实际情况决定,BHK-21还是比较好消化的,消化时间太长对细胞不利。可以在显微镜下观察消化情况,必要时可以拍打培养瓶帮助细胞分散。

   在90%单层细胞时,1:4传代2天后可长满。


   可参考ATCC:http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx?ATCCNum=CCL-10&Template=cellBiology

美国ATCC保存BHK21细胞株,编号为 CCL-10,为C13 克隆株。对于BHK21细胞, ATCC 推荐使用的培养方式为:使用含10%胎牛血清的MEM 培养基进行细胞培养,细胞培养温度为37.0°C,细胞培养后使用0.25%胰酶和0.03 %EDTA消化细胞,细胞分种比例为1:2-1:10,每周1-2 次细胞传代。





作者: missann111    时间: 2016-2-18 15:59
我养的hep-2细胞,操作流程如下:
1 取出T25细胞,已长满瓶子。
2 弃生长液。
3 用5ml PBS洗涤两遍。
4 加入0.25胰酶+0.02EDTA 1ml,使之铺满整个细胞。
5  37℃消化1-2min,至细胞圆缩,间隙变大,为单个分开,弃胰酶。
6 加入培养基5ml,吹洗掉全部细胞。
8 按照传代比例1:3加入生长液(10% FCS 1640),37℃培养


C6/36细胞,操作流程如下:
1 取出T25细胞,已长满瓶子。
2 弃生长液,尽量倒干净。
3 直接加入5ml生长培养基吹打,轻轻吹,不能拍打瓶子,贴壁较牢的不能吹下,不能加胰酶。
8 将吹下的按照传代比例1:2加入生长液(40%1640+60%DMEM+10%FBS),28℃培养

RD细胞,操作流程如下:
1 取出T25细胞,已长满瓶子。
2 弃生长液。
3 用5ml PBS洗涤两遍。
4 加入0.25胰酶+0.02EDTA 1ml,使之铺满整个细胞。
5  37℃消化1min,至细胞圆缩,间隙变大,为单个分开,弃胰酶,不能拍瓶子。
6 加入培养基5ml,吹洗掉全部细胞。
8 按照传代比例1:3加入生长液(10% FBS MEM),37℃培养
作者: yafei    时间: 2016-2-18 16:05
我们养的是MRC-5细胞,细胞刚开始复苏的时候状态还可以,细胞密度也是够的,但是细胞生长的特别缓慢,需要十几天才能长成单层,而且溶液里有一些圆缩的细胞,还有一些黑色的小颗粒,细胞形态变得比较乱,不是典型的成纤维细胞的样子了,然后消化之后再传代,细胞仍然长的很慢,形态变得更加不好,最后很难传下去了。我们用的是MEM+10%小牛血清,消化用的是胰酶-EDTA消化的。麻烦给点意见
作者: cao1976    时间: 2016-2-19 16:38
yafei 发表于 2016-2-18 16:05
我们养的是MRC-5细胞,细胞刚开始复苏的时候状态还可以,细胞密度也是够的,但是细胞生长的特别缓慢,需要 ...

照你的描述分析,估计是冻存环节出了问题, 复苏10几天长满那是肯定不对的  你用的生长液 消化液是常规的东西 应该没问题。  
不是怀疑你的技术 仅仅分析原因 别见怪:
二倍体细胞  相对于其他细胞系 属于很脆弱的。  
复苏的速溶是否妥当, 速溶环节很容易造成细胞死亡。
复苏后换液是否及时, 残留的DMSO对细胞生长是有毒的,虽然他能用来冻存。
细胞的代次,这细胞分散到各实验室后其生长状态也有很大的差异,有的可以传代到60 有的70  有的却只有50 , 所以要看你拿到的细胞本身怎么样, 疫苗生产要求的是寿命2/3代次使用,一方面是保证安全性,同时也是有其生长状态的原因的。 一般在40代以内应用,其活力水平会比较高。




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