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标题: G418筛选稳定表达细胞系 [打印本页]

作者: sure0623 时间: 2016-3-22 18:04
标题: G418筛选稳定表达细胞系
原理
分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80％的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，形成巨大的***结构最终整合进细胞染色体。细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。细菌Tn5转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性 ,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞 ,也包括原生动物和蠕虫。是稳定转染最常用的选择试剂。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达 ,使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。Ｇ418的这一选择特性 ,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转让时不加其它抗生素。其实G418本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。但有一点，其实我觉得问题也不是很大，那就是：在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗生素对细胞损伤较大。因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作用完全一样。所以没有必要再用，而且由于另外抗生素的添加实际增加氨基糖甙类药物的浓度，剂量有误差，不利于各实验室之间的交流，在实际操作中，培养液中有抗生素对细胞培养与筛选影响不大。
有人认为用磷酸钙共沉淀转染法筛选稳定整合子较好，但这种观点是很多年以前的观点了，而且只是少数人的观点。我两种方法都用过，但没有特异的比较过，感觉都可以。磷酸钙便宜，但对溶液配置和实验操作要求很高，尤其是溶液的PH值，要求精确到小数点后2位。脂质体是现在主流的转染试剂，从没有人说这种方法做整合稳定表达不行。非脂质体是这几年发展很快的技术，转染效率低，细胞毒性小，价格也不贵，Qiagen就有一个系列。我个人觉得不必要花太多时间在这方面，自己实验室用得好的技术可以坚持，没有经验的可以选择一个较著名的公司的产品开始，购买之前先下载个说明书看看。有精力就比较一下几种方法，一般的用达到目的就行了。关键是实验设计。
G418和筛选
筛选之前
由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/mL，在100ug/mL~1mg/mL的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
由于每种细胞对G418的敏感性不同，一般变动在100ug/ml～1000ug/ml范围。而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定你的细胞对这一批G418的最佳筛选浓度。尽管如此，特性明确的细胞系G418的最佳用量还是稳定的。《分子克隆》给出了几个常用细胞系所需G418的最佳用量。
细胞系或机体             G418浓度（ug/ml）
中国仓鼠卵巢细胞             700～800
Madin-Darby犬肾细胞                500
人上皮A431细胞                   400
猿CV-1细胞                            500
盘基网柄菌属                      10～35
植物                                  10
酵母                               125～500
   看下面的一个试验：3×106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48 h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。所以汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%！
加药时间
由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。这时药物浓度可以降至200ug/ml。
培养液
加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。这时会出现两个问题：1.死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡。2.孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。这个时候需要一种特殊的培养液：假如你要转染3T3细胞，在3T3细胞汇合度达到80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养液按1：1混合备用。再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。
挑选单克隆的优化
为了尽量减少阴性克隆的死亡给阳性克隆造成的不利影响以及增加阳性克隆的得率，可以应用套环法或刮除法结合有限稀释法来筛选阳性克隆。加药后，在高倍镜下，阳性克隆和阴性克隆很容易辨认，在阳性克隆下用记号笔做个标记。然后刮除隐性克隆，消化阳性克隆后继续筛选培养；或则用套环套住阳性克隆，在套环内加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一个新的孔中培养。最后再用有限稀释法把阳性克隆在96孔板中筛选。
鉴定之后
一般经过4周左右的筛选，得到的阳性克隆都比较稳定。但是外源基因如果没有整合到基因组中的话，目的基因还是很容易丢失的。但是外源基因整合到基因组中的概率太小了，而且是随机整合，会导致表达的目的蛋白的量产生很大差异。随着培养时间的延续，那些丢失了外源基因的细胞和很少表达目的基因的细胞会占据优势，强表达目的蛋白的细胞会越来越少。这样再次筛选是必不可少的。只有经过2次以上的筛选之后才能找到那种我们想要的强分泌目的蛋白的，遗传稳定的细胞克隆。
Protocal
1.G418的配制：取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。
2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右开始加药。
3.制备筛选培养基：在100ug/ml～1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。
4.加G418筛选: 吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。
5.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。方法同4。
6.确定最佳筛选浓度：在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况：用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的 G418的量在10天前就看不到活细胞了。假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml进一步筛选，以确定最佳筛选浓度！心得：由于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。比如说你要转染NIH3T3细胞，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是200 ug/ml。这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml三个浓度进行筛选。
通过预实验确定了最佳筛选浓度后，就可以做稳定转染了。
a 转染：转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合时；
b 加G418:去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基。
c 换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。筛选10～14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大后；
d 挑单克隆：制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/10ul。在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液10ul/孔。待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。
e 单克隆鉴定：细胞大量扩增后，提取总RNA，做RT-PCR检测目的基因是否存在。

作者: feanly 时间: 2016-4-9 13:48
学习了，感谢楼主分享。

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