研究背景
DNA的限制酶酶切和酶促连接作为基因工程的基础技术，是20世纪分子生物学方法的重要成就之一。在此基础上，研究者利用PCR (Rumsby, 2006)和定点突变(Baldrich and Goebel, 1990)等技术极大地拓展了重组DNA技术的应用。目前克隆方法多采用依赖连接酶的克隆方法，此法是一种经典的克隆方法，主要分为以下两种：1)粘性末端连接(Stols et al., 2002)，即载体质粒和待插入的外源片段都通过合适的限制性内切酶切割，产生相互匹配的粘性末端，然后在连接酶作用下重新形成磷酸二酯键而得到环化的重组质粒；2)平末端连接(Dieckman et al., 2002)，平末端连接中，载体和片段均为平端，都没有粘性末端突出。其优点是步骤简单，不需要多次酶切，但是克隆效率较低，而且不能实现定向克隆。总的来说，依赖连接酶的克隆方法简单高效，是克隆单个基因的常用的方法。但该技术也存在明显的不足：一方面，插入片段要经过限制性内切酶处理，这样在实验设计时就要考虑目的基因的DNA序列，不能实现多基因的平行操作，不适合高通量；另一方面，该过程使用连接酶，一方面延长了实验周期，另一方面也会带来载体自连背景，增加了筛选工作量。
然而在很多情况下，重组DNA技术的应用都会受到基因序列中原有的酶切位点的限制，尤其是多基因片段的重组往往更容易受到限制酶酶切位点序列的限制(Cheo et al., 2004)，研究者不得不使用一些非常稀有的酶切位点或者采用其它的DNA重组方法，大大增加了DNA重组的工作量和难度。因此，开发一种不受序列限制而且需要准确重组的新方法就显得十分重要。
Aslanidis和de Jong (1990)在1990年所提出的不依赖连接反应克隆(ligation-independent cloning, LIC)充分满足了上述要求。这种方式不仅克服了常规依赖连接酶克隆方法的缺点，而且操作简便、方法快捷及连接效率高，应用日益广泛。本文综述了LIC的实现方法特点，发展历程及其在目的基因克隆和蛋白融合表达中的应用。
1.1不依赖连接反应的克隆实现方法
在T4 DNA聚合酶的3′-5′外切酶活性下和一种特定的dNTP存在的缓冲液条件下反应，插入片段能产生10~15个碱基的粘性末端(Aslanidis and de Jong, 1990)。载体和PCR片段依靠长的粘性末端重组，此过程不需要连接酶。这种克隆方法不需要考虑插入片段的序列，任何基因都能被克隆到该载体中。而且，整个流程简单到不需要任何限制性内切酶和连接酶，两者在体外条件下孵化，互补的粘性末端退火形成环状分子，经转化进大肠杆菌细胞后，细菌的修复系统修复这些突出和缺口而得到正确重组子(图1)。图1中显示的是插入片段和载体均用PCR方式获得，然后用T4 DNA聚合酶处理，体外退火后直接转化大肠杆菌得重组质粒。
2不依赖连接反应的克隆方法的改进
Haun和Moss (1992)在此后的研究中，利用限制性内切酶消化使载体线性化，然后经T4 DNA聚合酶处理以产生长的粘性末端(图2)，这样的方式可以避免PCR过程中载体上产生突变(Kaluz and Flint, 1994)。这个过程中，载体的两粘性末端彼此无同源性，也没有使用连接酶，因而载体自连背景低，重组效率高。
图2 改进的不依赖于连接的克隆方法
在LIC理论基础上，2007年，Li和Elledge (2007)报道了一种不依赖于基因序列和连接反应的高效基因克隆方法(sequence and ligation-independent cloning, SLIC)。SLIC用途广泛，因为它不仅可用于任何2个基因片段的重组，更重要的是可实现多个DNA片段的一次性连接重组(图3)。由于不同基因片段之间长达30 bp的同源片段的存在，可以严格保证连接顺序与预期一致。SLIC只需要在PCR引物上加入与载体同源的20~30 bp DNA片度，不需要酶切和连接反应，极大地简化了DNA重组过程，由于在这种情况下不存在DNA分子自连接的可能性，更加简化了重组子的筛选过程。在不超过5个片段的情况下，可以保证转化子100%为重组子；在10个基因片段连接的情况下，16%的转化子为正确的重组子。
谈蓉和马立新(2009)构建了依次包含6His-tag，部分TEV位点，N.BbvCIA识别位点，Swa I位点的pET30a-LIC载体。LIC载体通过N.BbvCIA和Swa I双酶切产生5′粘性末端。使用LIC相配的引物扩增得到的PCR片段在dGTP缓冲液环境中被T4 DNA聚合酶处理后产生了互补的粘性末端。线性化的载体和PCR片段简单地混合，接着被转化进大肠杆菌体内。在重组质粒的亲和标签和靶蛋白之间会重构出完整的TEV蛋白酶切割位点，提高了LIC载体的使用性。此载体整合了LIC和TEV蛋白酶优势，提供了一个快速克隆靶向基因的平台和一个有效筛选可溶性蛋白和表达天然蛋白质的平台。与此方法类似，带有MBP，GST等其他几种不同的亲和融合标签的LIC表达载体已经被用于基因组表达计划(Cabrita et al., 2006; Dan et al., 2009)。Eschenfeldt等(2009)构建了15个LIC载体用于高通量克隆和表达蛋白，在一系列的LIC载体中采用MBP，GST亲和融合标签，改善表达蛋白的可溶性，这一系列的LIC载体在实际应用过程中经验证都具有很好的高通量可溶表达蛋白的能力。
在实际的运用过程中，有研究者(Akira et al., 2009)将目前已得到有效应用的商业化载体进行改造，设计缺失四种碱基之一的一段特殊序列代替繁杂的限制性内切酶位点，此载体通过T4 DNA聚合酶处理，产生长的粘性末端，可利用LIC原来插入各类目的基因进行有效的表达。
