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标题: 酚氯仿抽提DNA的具体步骤 [打印本页]

作者: drpeng 时间: 2016-7-21 20:20
标题: 酚氯仿抽提DNA的具体步骤
1上清中加入等体积的酚/氯仿抽提一次,等体积氯仿抽提一次;每次均要振荡—离心(10000rpm离心1min) —吸取上清到新的离心管中;
　注：吸取酚时，要枪头伸入两液面交接处下方，因为上层为水。
2上清中加入1/10 体积3M乙酸钠溶液(pH5.2) ,和2.2倍体积的无水乙醇,混匀后-20℃保存15min 。
3 12000rpm 4 ℃离心15分钟，弃去上清，沉淀加入1ml 75％乙醇洗涤， 12000rpm 离心2分钟，彻底弃去上清，真空干燥或烘干。
4.沉淀溶解于30ul TE溶液，取10ul 电泳检查

用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？

使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。
使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解作用。缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。

氯仿的作用？

氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。
最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）

用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？

异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？

用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。

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