中国病毒学论坛|我们一直在坚持！

标题: QRT-PCR用引物设计方案总结 [打印本页]

作者: douban 时间: 2016-7-26 22:08
标题: QRT-PCR用引物设计方案总结

概述：

在QRT-PCR过程中，由于涉及到模板定量，所以要求引物特异性强，并且不能扩增出基因组DNA（如果用DNA酶处理干净另当别论），所以要求跨外显子设计（可以不用考虑基因组DNA污染），或跨内含子设计（检验DNA酶是否处理干净，即无基因组DNA污染）。下面是自己在设计过程的一些心得体会，与大家分享之！

要求：

1. 上下游引物的长度一般为18-30bp之间，且Tm值在58-62℃之间，上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃。

2. GC=30-80%；

3. 应避免引物中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。引物的3’端最好不为G或/和C。引物3’端的5个碱基不应出现2个G或/和C。

4. PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150 bp最为合适（可以延长至300 bp）；

5. 要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在；

6. 而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响；

7. 至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS都可以的；

8. 关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用；

9. 避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构，同时也应避免引物间配对形成引物二聚体。

设计方案：

作者: ipsvirus 时间: 2016-7-27 20:12
给大家推荐一个QRT-PCR引物的网站——primerbank，输入基因名称或者基因号，可以选择那些验证过的引物（绿色标记）

作者: luil121 时间: 2016-7-29 13:00
好好学习了

作者: lydia 时间: 2018-11-30 17:31
谢谢分享，有没有测病毒在体内拷贝数方面的详细资料啊，感谢！

作者: horizon0-0 时间: 2019-5-8 11:52
谢谢，总结很实用，点赞一下

作者: apsail 时间: 2023-4-12 15:02
学习学习

作者: gyw 时间: 2023-9-4 19:31
感谢了，学习到了

欢迎光临中国病毒学论坛|我们一直在坚持！ (http://bbs.virology.com.cn/)