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标题: 包涵体表达小技巧之四：柱子回收与再利用 [打印本页]

作者: atfsu15 时间: 2016-8-23 08:04
标题: 包涵体表达小技巧之四：柱子回收与再利用
勤俭持家是中华民族的传统美德，如果你想节约自己的柱子，就和胖胖一起玩柱子回收吧。

以市售Sepharose（常用的所谓Fast Flow）和NTA柱子为例。

洗脱蛋白后的柱子，实际上还是很脏，N多杂质在上面，还有很多目标蛋白，算了，洗不下来就忍了。

步骤：
10倍柱体积0.5M NaOH洗柱1次，弃上清；
10倍柱体积水洗1-2次；
5倍体积复性液（6M盐酸胍或8M尿素，0.2M 醋酸，pH4.0）洗柱一次。PS：一般NaOH洗后有棕色沉淀，而复性液洗后有白色沉淀，都是乱七八糟的蛋白——实际上，pH4.0条件会让蛋白掉下来，推理到纯化过程的洗脱一步，如果你不想用咪唑置换His，那不妨用pH4.0的洗脱液，如果你的蛋白不怕酸的话。
10倍柱体积水洗1-2次；
到这里，你的柱子可以再经20%乙醇或0.5M NaOH洗一次，就可保存到相应的保护液里面了。如果柱子已经经历了3次蛋白纯化，那么可继续进行下面步骤。

水洗后的柱子加入2倍柱体积0.2%SDS洗1次；
10倍体积水洗1次以去除SDS；
2倍体积25%乙醇洗1次；
2倍体积50%乙醇洗1次；
2倍体积75%乙醇洗1次；
5倍体积100%乙醇洗1次；
2倍体积75%乙醇洗1次；
2倍体积50%乙醇洗1次；
2倍体积25%乙醇洗1次；
10倍体积水洗1次；
5倍体积100 mM EDTA洗1次，这时柱子应该恢复成白色，因为金属离子被螯合了。
10倍体积水洗1-2次，完全去掉EDTA；
加入你用的金属离子重新结合柱子，室温1小时够了；
10倍体积水洗1次，以去掉没结合的金属离子；
5倍体积复性液洗1次；
到这里，再用你柱子保存液洗柱1次就可以把柱子保存起来了。
到了该让蛋白结合柱子的时候，可以再拿复性液洗1次，然后变性液洗1-2次，让柱子适应了pH8.0的变性环境，就可以加入蛋白变性后的溶液了。

对于用His结合柱子的蛋白，不推荐使用还原剂如DTT、2巯基乙醇或还原型谷胱甘肽，如果你的蛋白很大（>100kDa），可以在变性时少量加入还原剂，但还原剂影响蛋白结合柱子。要用就用稳定的2巯基乙醇，如果下游要注射到动物或上细胞，也不必害怕2巯基乙醇的毒性，因为整个纯化洗脱透析过程已经把最开始的那点东西踢得干干净净了

节约型社会是和谐社会的基本特征之一

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