Cell：新发现两个CRISPR/Cas9系统天然抑制蛋白 - 中国病毒学论坛|我们一直在坚持！

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2016年12月29日，Cell杂志在线发表了来自美国旧金山加利福尼亚大学Joseph Bondy-Denomy 研究团队的关于能够抑制CRISPR/Cas9系统的噬菌体蛋白研究工作，论文标题为“Inhibition of CRISPR-Cas9 with Bacteriophage Proteins”,论文第一作者为Benjamin J. Rauch 博士后研究员。

CRISPR/Cas9基因编辑技术是近年生物技术领域的热点，它是细菌和古细菌在长期选择压力中形成的一种适应性免疫防御，可用来有效抵御病毒及外源DNA的入侵。其中，CRISPR的Type II已经被广泛用于基因工程，它包含Cas9，crRNA和tracrRNA，其中crRNA含有能够识别20bp的靶向互补序列。Cas9，crRNA和tracrRNA组成复合体，识别并结合crRNA互补的序列，然后解开DNA双链，Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链，最终导致DNA的双链断裂（DSB），进而实现基因的敲除和插入。细菌或古细菌可利用CRISPR/Cas9系统抵御病毒及外源DNA的入侵，反过来，病毒（如噬菌体）也可产生某些特定蛋白来抑制CRISPR/Cas9系统的功能。目前已鉴定出相关蛋白可阻止CRISPR/Cas9 I型系统的功能，但是抑制CRISPR/Cas9 II型系统的相关蛋白没有得到鉴定。

该论文研究人员先假设细菌基因组中可能含有一种抑制剂来阻止CRISPR/Cas9系统切割其自身基因组的靶标，进而结合生物信息学等方法在细菌基因组中寻找CRISPR序列和它的靶标而发现这些CRISPR/Cas9抑制蛋白。研究人员发现了由单核细胞增多性李斯特氏菌噬菌体(Listeria monocytogenes prophages)编码的4个独特的type II-A CRISPR/Cas抑制蛋白。超过一半的含有Cas9系统的单核细胞增多性李斯特氏菌噬菌体种含有至少一个前噬菌体编码的抑制蛋白。该研究还发现，其中2个抑制CRISPR/Cas9的蛋白（AcrIIA2和AcrIIA4）在大肠杆菌和人细胞中都证实了可以抑制来自酿浓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9系统。该研究论文第一作者Benjamin Rauch认为下一步的研究将在人细胞中证实利用这些抑制剂是否可降低脱靶效应，以期能够真正地改善基因编辑准确性。同时，他们还将精确地研究这些抑制剂蛋白是如何阻断Cas9基因靶向修饰能力，并且继续在其它菌属中寻找更多的更有效的CRISPR/Cas9抑制剂。

本研究所鉴定出的自然条件下存在的CRISPR/Cas9系统特异性的抑制蛋白将为研究CRISPR/Cas9功能提供了宝贵的新的工具，同时这些抑制蛋白可用于基因工程中调控CRISPR/Cas9活性。在大肠杆菌和人细胞中可抑制Cas9功能的AcrIIA蛋白还表明这类蛋白可能是Cas9转录后的分子开关。这一特征将使得CRISPR/Cas9工具更加完善，如可利用这些抑制蛋白减少Cas9蛋白停留在细胞核的时间以期降低基因编辑的脱靶效率。同时，继续在其它菌属中寻找更多的更有效的CRISPR/Cas9抑制剂也将具有非常重要的意义。

Bacterial CRISPR-Cas systems utilize sequence-specific RNA-guided nucleases to defend against bacteriophage infection. As a countermeasure, numerous phages are known that produce proteins to block the function of class 1 CRISPR-Cas systems. However, currently no proteins are known to inhibit the widely used class 2 CRISPR-Cas9 system. To find these inhibitors, we searched cas9-containing bacterial genomes for the co-existence of a CRISPR spacer and its target, a potential indicator for CRISPR inhibition. This analysis led to the discovery of four unique type II-A CRISPR-Cas9 inhibitor proteins encoded by Listeria monocytogenes prophages. More than half of L. monocytogenes strains with cas9 contain at least one prophage-encoded inhibitor, suggesting widespread CRISPR-Cas9 inactivation. Two of these inhibitors also blocked the widely used Streptococcus pyogenes Cas9 when assayed in Escherichia coli and human cells. These natural Cas9-specific “anti-CRISPRs” present tools that can be used to regulate the genome engineering activities of CRISPR-Cas9.