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标题: GST-pull down 实验步骤 [打印本页]

作者: wwwkkk83 时间: 2017-4-25 08:47
标题: GST-pull down 实验步骤

1. 大量制备GST蛋白

1) 活化冻存菌种GST和GST-X：按1：50比例将表达蛋白的冻存菌液加入5ｍｌＬＢ（Ａｍｐ＋），37℃，140~150rpm培养过夜

2) 将过夜培养物按1：100比例接入200mlＬＢ（Ａｍｐ＋），220rpm，30℃培养至OD600=0.4-0.6

3) 以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋白。（IPTG 0.5mM，20℃，150rpm培养10~16小时）

4) 诱导适当时间后，4℃，5000g离心10min后弃上清。（如需要该步沉淀能保存在-80℃）

5) 重悬沉淀：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬

6) 冰上超声沉淀重悬液：2S 间隔1S 至悬液透明（一般可容性蛋白：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬液超声６～９min可透明）

7) 10，000g，10min离心上清转移至新的离心管，加DTT至终浓度1mmol/L

2. 谷胱甘肽-琼脂糖树脂的处理

1) 轻轻颠倒树脂盛装容器，混成匀浆

2) 取适量匀浆放入离心管中，4℃，500g离心5min后弃上清（每10ml 细菌培养物可以用50ul匀浆）

3) 每1.33mL 初始匀浆加入10 mL 4℃预冷的PBS，颠倒混匀后，4℃，500g离心5min后弃上清（50ul初始匀浆用400ulPBS洗）

4) 每1.33mL 初始匀浆加入1 mL 冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒混匀置冰上放置待用。（50ul初始匀浆加入40ulPBS）

3. 结合GST蛋白

1) 上清与适量50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，4℃轻摇30min（可过夜让其充分结合）。

2) 4℃，500g离心5min后弃上清

3) 沉淀加入10倍床柱体积PBS（1床柱体积=0.5*50%匀浆体积）(50ul初始匀浆用400ulPBS洗），颠倒混匀以洗去未与树脂结合的杂蛋白（每次可在混旋仪上混匀5min)

4) 4℃，５00g离心5min后弃上清

5) 重复步骤3和4两次，共三次

4. 预清除细胞裂解液

1) 将细胞裂解液与50ul的和GST结合的50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂悬液在4℃翻转混合孵育2h。（需要检测相互作用的裂解液的量是高度可变的。开始用相当于1×106~1×107个细胞的裂解液。）

2) 离心，4℃，13，000rpm，2min

3) 将上清转移到新的离心管中

5. 探测细胞裂解液

1) 设定两个等量预清除的细胞裂解液分别加入到结合GST和GST-X蛋白的谷胱甘肽-琼脂糖树脂中，4℃翻转混合孵育2h（时间可适当延长，如过夜以让其充分结合）

2) 离心，4℃，13，000rpm，2min

3) 用1ml冰冷的细胞裂解液洗涤，4℃，13，000rpm，2min，弃上清，重复洗三次

4) 加入50ul的2×Loading Buffer。轻弹混匀，沸水煮5~10min，离心后收集上清。

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