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标题: 【文献阅读】抗体诱导人呼吸道合胞体病毒融合蛋白发生内化 [打印本页]

作者: hantavirus 时间: 2017-7-18 09:07
标题: 【文献阅读】抗体诱导人呼吸道合胞体病毒融合蛋白发生内化
近日，比利时，美国，西班牙和英国的科学家联合在Journal of Virology的杂志上发表题为“Antibody-induced internalization of the human respiratory syncytialvirus fusion protein”的文章。该研究通过使用特异性结合RSV感染细胞后表达于细胞表面蛋白的抗体，来揭示抗原-抗体复合物结合后的内化过程。该研究揭示了抗原-抗体复合物的内化作用，一方面可干扰病毒颗粒的形成及增殖达到抗病毒的效果，另一方面这一内化机制也降低了抗体对感染细胞介导效应机制的效果。

人呼吸道合胞体病毒（RVS）是一种能够造成孩童，老人及免疫功能不全的病人严重下呼吸道感染性疾病的病毒。基本上所有两岁的孩童，在RVS暴露的时候都会发生感染。同时早产，支气管肺发育不良及先天性心脏病也是发生严重RVS疾病的重要风险因素。成人RVS感染也可造成严重疾病，甚至导致终身RVS的反复感染。尽管在1956年的时候就已经发现了RVS的存在，但目前还没有安全有效的疫苗来防控RVS。对于严重感染病例的治疗还是通过平衡机体的水合及氧化作用的基本支持性疗法。
RVS属于肺病毒科，偏肺病毒属的负链RNA病毒。RVS基因组全长15.2Kb，其中包含10个基因编码11个蛋白。在这些编码的蛋白中，G糖蛋白、小疏水蛋白和F蛋白为RVS表面糖蛋白。F蛋白能够融合病毒和细胞的膜，并促使感染的细胞融合临近的细胞，形成大的合胞体。F蛋白是RVS在体外复制过程中必不可少的蛋白。该蛋白的保守性强，包含有6个主要的抗原位点，容易刺激机体产生中和性抗体，是保护性疫苗开发的首选。目前，RVS的F蛋白是免疫预防及疫苗研究主要关注点。预防性接种F蛋白特异性抗体能够防止婴儿RVS感染后疾病的恶化。然而，在自然感染RVS后建立的抗体应答无法保护病毒的再次感染，高水平的抗体滴度与保护力之间不呈相关性。因此，科学家们推测RSV可能潜在有干扰抗体介导中和作用的能力。

1、抗体诱导RSV抗原内化作用：为了评估抗体诱导RVS抗原的内化作用，研究人员首先使用RSV感染的HEp-2和A549细胞孵育羊抗RSV多克隆抗体1h，之后固定细胞，用AF488驴抗羊IgG抗体孵育。结果发现在试验的初期，荧光信号主要出现在细胞的表面，在细胞质中没有荧光信号。在试验1小时后，细胞质中发现了大量的荧光信号，同时细胞表面的在减少。

2、使用不同的RSV毒株和血清研究抗体诱导RSV抗原内化作用：研究人员通过使用RSV的参考毒株B1和临床分离毒株A1998/3-2，山羊抗RSV和人抗RSV抗体进行对比试验发现其结果也是在试验的初期，荧光信号主要出现在细胞的表面。在试验1小时后，细胞质中发现了大量的荧光信号，同时细胞表面的在减少。

3、在分化良好的原代支气管上皮细胞（WD-PBECs）中研究抗体诱导RSV抗原内化作用：研究人员通过使用WD-PBECs及人抗RSV特异性抗体，发现在试验120min之后超过80%的RSV感染细胞出现了RSV抗原-抗体复合物的内化。

4、确定参与内化过程的细胞表面RSV蛋白：RSV表面糖蛋白F和G是连个主要的表面抗原。研究人员通过使用两种不同的细胞（HEp-2和A549）、F蛋白特异性抗体和G蛋白特异性抗体发现两种蛋白都有大量抗原-抗体复合物的内化（图A）。通过单独转染RSV的F和G蛋白至BSR T7/5细胞研究，得到的也是相似的结果（图B）。

5、抑制剂和DN蛋白对抗体诱导RSV F蛋白内化作用的影响：研究人员通过使用RSV F蛋白抗体分别和不同浓度的内吞抑制剂，酰胺化动力蛋白抑制肽DIP（图A），金刚烷胺（图C），和制霉菌素（图E）混合后孵育于RSV感染HEp-2细胞。结果表明DIP能够减少大约50%内化囊泡。通过使用共转染DN蛋白（动力蛋白2（图B），Epsl15（图D），窖蛋白-1（图F）），发现动力蛋白2能够显著降低内化囊泡（62.01%）。

6、自发内化作用分析：研究人员通过使用不可透过膜的生物素标记试剂标记RSV感染和未感染的HEp-2细胞，来研究RSV的F蛋白的自发内化作用。结果发现，在抗体诱导和自发内化两种情况中，细胞内RSV 的F蛋白的数量是不同的。该结果证实RSV的F蛋白的内化作用主要是由于抗体诱导的。

7、Fab片段的内化作用：为了鉴定RSV的F蛋白内化是否需要交联耦合作用，研究人员使用RSV的F蛋白特异性单克隆抗体的单价Fab片段与完整的抗体进行对比试验，结果发现单价Fab片段诱导的RSV F蛋白内化作用与完整抗体相比显著降低，说明交联耦合作用在RSV F蛋白的内化过程中起到了重要作用。

本期编辑：木木

作者: hantavirus 时间: 2017-7-18 11:18
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