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标题: 杆状病毒的转导机制 [打印本页]

作者: 樽满秋华 时间: 2015-5-24 12:42
标题: 杆状病毒的转导机制
   原帖地址：http://biosky.haotui.com/thread-2446-1-14.html 原帖发布人：xiazhaohe
   昆虫杆状病毒载体系统已广泛应用于表达重组蛋白。1995年，首次利用含有哺乳动物细胞表达盒的重组杆状病毒在人肝细胞内表达了外源基因。随后的研究证明，重组杆状病毒可将外源基因有效导入多种哺乳动物细胞中，包括非肝源细胞系和原代细胞。
   迄今，杆状病毒可有效转导多种细胞系，但病毒进入机制以及病毒进入后在细胞内的运输过程研究的还不清楚。用含DMSO的培养液在胶原平板上培养兔肝细胞，细胞成岛屿状生长。此时杆状病毒只能转导周边细胞。在培养液中加入EGTA后，由于EGTA使得粘连蛋白内化，从而干扰细胞粘合，细胞间隙增大，这时杆状病毒可转导岛屿内部细胞。这些发现表明，杆状病毒通过基底表面进入肝细胞。杆状病毒囊膜糖蛋白gp64可以与外源蛋白融合表达，并将外源蛋白展示在病毒颗粒表面。这一特性已被开发作为BacMam系统转导细胞的标记。用表达GFP与gp64融合蛋白的重组杆状病毒来检测病毒进入细胞后的去向，发现转导4h后，在有效转导的细胞内，可观察到病毒标记的核衣壳位于转导细胞核内。同样，用表面展示GFP蛋白的重组杆状病毒来研究AcMNPV进入肝癌细胞的过程，通过电子显微镜观察到病毒最初位于细胞表面，由电子密度较高的类似网格蛋白的物质包裹着。随后，杆状病毒被发现位于较大无包膜的胞浆膜内陷（invaginations）和类似巨胞饮体的小泡内。在双标记实验中，转导后30min，利用共聚焦显微镜在早期内体中观察到病毒粒子，45min后，在晚期内体中观察到病毒粒子，而在循环内体和高尔基复合体中未观察到杆状病毒。由此推测，AcMNPV通过网格蛋白以胞吞或者巨胞饮（macropinocytosis）的方式进入哺乳动物细胞内。
另一项研究数据也显示杆状病毒通过胞吞进入细胞，然后再经过酸诱导的融合作用，将核衣壳释放到胞浆内。电子显微镜观察到雪茄状的核衣壳蛋白位于未分裂细胞的核孔上。随后，在细胞核内观察到病毒基因组、主要衣壳蛋白、高电子密度的衣壳蛋白。这表明病毒核衣壳通过核孔运输至细胞核内。这种运输模式与其它同样拥有较大球状衣壳蛋白的病毒（如单纯疱疹病毒和腺病毒）不同，后者在将基因组运输至细胞核之前，并不在核孔聚集。
重组病毒转导哺乳动物细胞后，外源基因可以瞬时表达，也可以稳定表达。在148kb的重组杆状病毒DNA中，有一些5~18kb大小的不连续的片断以单拷贝整合到细胞基因组中，连续传36代，整合的细胞保持表达报告基因的能力。

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