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标题: 朊毒体及海绵状脑病的研究进展 [打印本页]

作者: virology 时间: 2015-6-19 08:52
标题: 朊毒体及海绵状脑病的研究进展
传染病学教授　　李梦东

　　传染性和家族性人类中枢神经系统以慢性海绵状退行性变为特征的疾患：如克鲁兹弗得—雅柯病（Creutzfeldt-Jakob disease,CJD）、杰茨曼-斯脱司勒-史茵克综合征（Gerstmann-Staussler-Scheinker syndrome,GSS）、致死性家族性失眠症（fatal familial insomnia, FFI）及库鲁（kuru）的病原曾认为都是慢性病毒感染所致，但始终未能分离出病毒。1967年，Griffith 曾提出这种致病因子的复制可能不需要核酸模板。至1982年，Prusiner等正式提出此类疾患的病原体可能是一种传染性蛋白质粒子 (Proteinaceous infectious particles),并且组建prion蛋白（PrP）一词代表这种因子，曾有人译为朊病毒或锯蛋白，既然缺乏核酸再称病毒似欠妥当，称朊毒体似更合适。近来,毛江森院士建议译为朊毒。关于朊毒体学说研究得比较深入而渐渐得到认可，此项研究已获得1997年度医学诺贝尔奖。
　　此类蛋白质（prions）也是多种动物类似疾患的病原，如牛海绵状脑病（bovine spongiform encephalopathy, BSE）羊、猫或其他动物的瘙痒症(scrapie) ，传播性貂脑病，北美黑尾鹿及大角鹿的慢性废墟病（chronic wasting disease）等。许多学者认为由于进食或在饲料添加剂中加入患瘙痒症动物的肉或内脏，可使动物受染而发病，正像巴布新几内亚高原地区进食死者的大脑表示祭祀，从而受染库鲁一样。BSE也称疯牛病（mad cow disease），从1986年至1998年8月英国已将240万头病牛或可疑病牛焚烧，使英国的牛肉出口及有关牛的生物及医药制品遭受重大损失达150 亿美元，数十万人失业。由于怀疑疯牛病有可能传染给人类，因而对人类已造成很大威胁及恐惧。事实上早在1995年，英国科学家已经发现了新型克雅病，但直到1996年3月，英国政府才正式承认疯牛病有可能传染给人类。今年2月17日向法院提起诉讼的两名法国受害者家属是今年2月4日去世的36岁妇女洛朗斯的哥哥以及目前正濒临死亡的19岁少年阿尔诺的父母。他们以“致使他人中毒、过失杀人以及令他人生命处于危险之中”等罪名正式向巴黎大法院起诉法国、英国政府以及欧盟委员会等有关机构。他们在起诉书中说，从开始发现疯牛病，英国、法国政府以及欧盟委员会等对疯牛病的危害性就没有给予足够的重视，致使疯牛病逐渐向人类泛滥，据保守的估计，未来英国死于“克雅病”的病人将超过13万，而法国的潜在患病人数也在7 000以上。起诉书中指出，虽然欧盟为防止疯牛病传染到欧洲大陆而采取了禁止英国牛肉出口的措施，但并未能有效地执行，1988～1996年之间，英国牛肉仍大批出口到欧洲各国。尤其令人气愤的是，英国在1989年禁止向国内销售牛头以及牛内脏的同时，却有增无减地向其它国家出口，1988～1996年的出口量几乎是1978～1987年的20倍，总量达到7.84万吨。控方指责英国政府为了自身的经济利益而不顾消费者的健康安全是极端自私的，而欧盟直到 1996年才开始全面禁止使用这种饲料也难辞其咎。联合国粮农组织认为凡进口这种饲料的国家或早或迟都会发生疯牛病。近期，日本已证实有疯牛病存在。
　　最近有关资料报道英国疯牛病调查机构已正式发表有关疯牛病危机的长篇调查报告，英国政府同时宣布，将对疯牛病受害者家庭进行赔偿，先期的100万英镑赔偿金已经启动。
一、朊毒体学说的形成
　　早在50年代，Alper等曾提出动物瘙痒症的传染因子可能缺乏核酸，至1967年Griffith等再次强调这种致病因子的复制可能不需要核酸模板。经过近20年的研究，许多实验已证明患瘙痒症的绵羊大脑提取液的传染性可以通过细菌滤器，因而曾怀疑为病毒所致，但是用灭活核酸的手段处理这种提取液，例如煮沸，紫外线或离子照射，特异地改变或破坏核酸的制剂如核酸酶、补骨脂素（psoralens）、羟胺或锌离子等处理瘙痒症动物的脑匀浆、微粒体组分、纯化的朊毒体制备柱，都不能改变其传染性，因而Prusiner等着手进行深入的研究，在叙利亚金田鼠身上作了大量实验，获得许多重要进展。
将纯化的瘙痒症动物PrP接种田鼠，从富含传染因子的田鼠（HA）大脑组织获得的亚细胞组分，证明有一种对蛋白酶敏感的蛋白质，分子量33～35KD，定名为PrP，对蛋白酶有抗性的蛋白质，分子量27～30KD，定名为PrPsc，后者是前者的致病特异性重要成分，对照组动物缺乏此蛋白质。把PrP27 -30进一步纯化成单一成分后，感染田鼠及小鼠（MO），再从受感染动物大脑中分离出PrP的mRNA，构建cDNA库，对此cDNA的表达产物测序表明，Ha及Mo PrP的cDNA编码蛋白为254个氨基酸，而人类PrP由253个氨基酸组成，信号肽（SP）位于NH2末端，有22个氨基酸。当PrPc在粗面内质网中合成后，经高尔基器加以修饰，然后转运到细胞膜内面，以糖磷脂酰肌醇（glycophosphatidyl inositol, GPI）为支持点而结合。此时，PrP的-COOH基端可删去23个氨基酸，信号肽被裂解。对朊毒体的分子生物学及结构深入研究，有可能在细胞自我调节及机体内环境稳定的机理方面，揭开一个崭新的领域。
二、朊毒体的构型及特征
　　利用分子探针技术证明正常人PrP基因位于第20对染色体的短臂上，并证明PrPc是人类及动物细胞内的正常成分。序列测定表明PrPc与PrPsc 之间并无差别，同属一种蛋白质却有两种构型。这两种异购体都曾在未变性的条件下加以纯化，他们的次级结构均用傅里叶变换红外及圆振二向色性光谱镜（Fourier transorm infrared and circular dichroism spectroscopy）加以测定。发现PrPc α-螺旋高达42%，β-片层仅3%，而PrPsc的蛋白骨架却完全伸展形成的β片层高达43%，α螺旋仅30%。
　　在培养细胞内，PrPc向PrPsc的转变发生在神经元内部，此后PrPsc在溶酶体中沉积。在大脑中填满PrPsc及伴随的杆状淀粉样（amyloid）颗粒的溶酶体，会突然爆破并损害细胞。当宿主的神经细胞死亡后，在脑组织中留下许多小孔如海绵状，释出的PrPsc会袭击另外的细胞，这是朊毒体的重要特点。
　　人类朊毒体病大约有15%的患者为遗传性，均为常染色体显性遗传，其余为传染性病例包括医源性及散发性。已经证明在遗传性患者的家族中均有PrP基因的突变（在人类命名为PRNP）。PrP基因内有突变的个体，对于从α-螺旋向β-片层的转变特别易感，遇到外来致病因子（例如PrPsc）时，约有一半成员会发病，其潜伏期的长短与接触的剂量、毒株有密切关系。PrP既然缺乏核酸，株型的不同在于构型的差别，一种PrP能高度有效地折叠PrPc成为致病性，表现为较短潜伏期，另一种方式折叠可能不太有效而潜伏期较长（潜伏期为4～40年，平均10～15年）。即使是同一构型，也可能沉积于大脑不同的神经元群内，从而产生不同的临床表现。
三、朊毒体的复制
　　用瘙痒症传染因子感染培养细胞的脉冲示踪（pulse-chase）实验表明，PrP的转变是翻译后反应。瘙痒症蛋白接触到PrPc分子后，会使 PrPc发生构型转变成为致病性PrPsc。这种反应类似瀑布型，已发生转变的分子又可使其他正常分子发生转变。在携带PrP基因点突变或插入突变的个体，突变的PrPc分子有可能自发地转变成PrPsc。虽然起初随机反应可能达不到致病作用，一旦出现此类转变之后，会发生自动催化反应（autocatalytic event），使PrPsc呈指数形式剧增。这一机理可以解释有些人隐藏有胚胎时的突变而数十年并不发生中枢神经系统的退行性变，因为PrPsc在大脑上中的蓄积是缓慢的。大脑中PrPsc已有蓄积而PrPc的mRNA仍不改变，也说明这种转变是蛋白质的翻译后反应。
　　朊毒体由PrPc或其前体向PrPsc的转变及复制，似乎不需要任何化学性修饰，一个PrPc分子与一个PrPsc分子结合，形成一个杂合二聚体（heterodimer）或可能是三聚体（trimer），此二聚体会转化成两个PrPsc分子，以后便可呈指数增殖，这种二聚体乃复制的中间体，这些结果均在转基因小鼠身上得到证明。
　　Brown等及Goldfarb等关于PrP基因突变的研究均表明，人类PrP基因的129位密码子有多态性。在白种人约38%为纯合子的M（蛋氨酸）等位基因，51%为杂合子，11%为纯合子V（缬氨酸）。大多数散发性CJD发生于这种纯合子个体，而密码子129个杂合子者发生朊毒体病的危险性最低。家族性CJD和FFI在临床及病理学上是显然不同的两种亚型，但两者均呈PrP基因内178位密码子天冬氨酸（ASP178）向天冬酰胺（ASN178）相同的突变，只是密码子129的多态性不同而已。在5个家族中所有15例患FFI者，均为ASN178等位基因及M129，而 ASN178等位基因及V129者见于6个家族中所有15例患CJD亚型者。朊毒体病患者其他的基因突变也见于密码子102、200、117、198等。
四、朊毒体的传播及种属屏障
　　Brown等将美国国立卫生研究院（NIH）1963～1993年间，收集到各国（主要是美国及欧洲）1113例各种神经病中的300例，曾将大脑组织浸液接种给非人灵长类动物3418只的实验结果进行了综合分析。此300例海绵状脑病包括CJD患者278例，其中234例散发性，36例为家族性，8 例为医源性（如角膜移植或其他手术）：库鲁18例及GSS综合征4例。分析结果表明，医源性CJD的传播率最高（100%），库鲁次之（95%），散发性 CJD也较高（90%），大多数家族性疾患的传播率较低（68%）。
　　人们当前普遍关注的问题是疯牛病能否传给人？直接回答这一问题是有困难的，因为不可能把动物大脑浸液接种给人，而且需要观察的潜伏期很长才有可能作出结论。关于种属屏障（species barrier）的研究资料是大量的，实验结果表明，小鼠PrP基因在254个氨基酸中有16个不同于田鼠基因，给转基因小鼠接种小鼠PrPsc时，会制造重多的小鼠PrPsc，当接种田鼠PrPsc也会制造田鼠PrPsc，但优先与同种或序列相近的PrPc相互作用，说明种属屏障并不严格。绵羊与牛的 PrP基因仅有7个密码子的差别，故而羊瘙痒症易于传播给牛，而人与牛的PrP基因之间有30个以上的密码子差别，故而有些学者认为牛传播给人的可能性较小，但人PrPsc可传播给田鼠已经证实。人与小鼠的PrP基因有28个密码子的差别，把患CJD或GSS综合征病人的脑组织接种到转人类部分PrP基因的小鼠，发现比携带人类全部PrP基因的小鼠发病更快，频率更高，说明PrP分子核心成分的相似性在促进发病的地位更为重要。
　　除家族性朊毒体病之外，少部分病人的传染途径为医源性。已知用人类尸体—垂体制备的生长激素或性腺激素，硬脑膜或角膜移植，应用消毒不充分的神经外科器械等均有可能使人受染。虽然，大多数人类散发性朊毒体病的原因并不明确，但是，研究证明，用传统的甲醛消毒，并不能把这种传染因子杀灭，经120 ~ 130℃加热4小时仍有感染性的结论，怀疑在环境中受人类或动物朊毒体传染的问题颇值得重视。过去认为CJD可发生夫妻间人与人的水平传播，但近期的报告并末能证实。Collinge等的研究表明，表达人类PrP的转基因小鼠，除表达小鼠PrP之外，还可以产生人类PrPsc,因此这些小鼠可作为模型对朊毒体病进行研究。同时，他们将2例FFI患者的大脑匀浆接种给转人类基因小鼠后，经过438～641天的潜伏期，小鼠均出现FFI的表现及病理变化。他们认为这种传播率较低的FFI模型是成功的。同时Tatelshi 等已报道用FFI病人的脑匀浆接种给NZW株小鼠而获得成功，进一步证明种属屏障是不可靠的。而且Collinge 等还发现从各种CJD病例获得的 PrP，经蛋白酶K处理后的蛋白印迹实验（western blot）,可将这类PrPsc分为四型（株），I型及Ⅱ型与散发型CJD有关，Ⅲ型与医源性CJD有关。唯独nvCJD患者PrPsc的电泳条带（第4 型）与自然传播的BSE非常类似，因而结论认为疯牛病可能是人类nvCJD的传染来源。
　　过去认为朊毒体病大多发生于60岁以上，以往在英国报告的散发性CJD患者中，仅有2例青年（16及18岁）。近来Howard等又报告一例28岁妇女患不典型CJD经额叶活检及尸检证实。Will等报告10例英国青年患者变异型CJD之后，Chazot等又报告一例26岁男性法国机械师患CJD，他们认为这类患者虽与牛无接触史，但曾经与牛肉的接触或进食疯牛肉是最大可能的发病原因。并认为即使牛与人之间有高度有效的种属屏障，也不能排除大量接触过 BSE的人群中，少部分易感者已被感染的可能。近期在有疯牛病的英国牛群中两个饲养员死于CJD的事实，已引起严重关注。人类与饲养的猫同时散发CJD的病例也有报道。
　　到1997年2月底，至少证实有17例新变异型CJD（简称nvCJD）患者，而且以后不断有类似病例出现，例如2000年10月28日，英国又有一名14岁女孩死于疯牛病，使英国因这种疾病死亡的人数增至86人。女孩母亲怀疑女儿是因为小时经常吃平价牛肉汉堡包，导致染上疯牛病。同一天美国新奥尔良图兰大学医院透露，8名患者在手术后感染了一种罕见的致命性脑病，这8人都使用过同一套手术仪器，而此前一名使用了该套仪器的脑病患者已经不治身亡，该患者乃感染变异新型克雅病所致。估计这种新型CJD将以总人口的1/百万/年的频率出现。在我国山东省报告的一例克雅病患者（中华传染病杂志2000年18 （4）：256），不得不使人深思并应加以探讨。
　　以往对于朊毒体病的确诊主要依靠脑活检或尸检。目前已有可能利用抗大脑蛋白质14-3-3的单克隆抗体对患者的脑脊液进行免疫学筛选及初步诊断，或利用扁桃体活检明确诊断。
　　关于朊毒体的发现及其所涉及的问题是很有意义的。有必要深入研究正常细胞如何监控蛋白质构型，又如何处理错误折叠的蛋白质，进而研究用新的手段稳定 PrPc中的α-螺旋，抑制它们向β—片层转化，从而达到防治人类大脑退行性变的发生与发展。当前除传统上的传染病病原微生物及寄生虫之外，又增加了一种全新类型的病原因子，这不能不说是医学上的又一奇迹。

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