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标题: 数字PCR技术（Digital PCR-dPCR）介绍 [打印本页]

作者: wwwkkk83 时间: 2015-2-4 10:51
标题: 数字PCR技术（Digital PCR-dPCR）介绍
数字PCR技术的原理
数字PCR（Digital PCR-dPCR）技术是一种新的核酸检测和定量方法，与传统定量PCR（qPCR）技术不同，数字PCR采用绝对定量的方式，不依赖于标准曲线和参照样本，直接检测目标序列的拷贝数。由于这种检测方式具有比传统qPCR更加出色的灵敏度和特异性、精确性，dPCR迅速得到广泛的应用，这项技术在极微量核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测和表达量微小差异鉴定方面变现出的优势已被普遍认可，而其在基因表达研究、microRNA研究、基因组拷贝数鉴定、癌症标志物稀有突变检测、致病微生物鉴定、转基因成分鉴定、NGS测序文库精确定量和结果验证等诸多方面具有的广阔应用前景已经受到越来越多的关注。

数字PCR采用的策略概括起来非常简单，就是“分而治之”（divide and conquer），这种做法非常类似于计算机科学中的“分治算法”，将一个标准PCR反应分配到大量微小的反应器中，在每个反应器中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子( DNA模板) ，实现“单分子模板PCR扩增”，扩增结束后，通过阳性反应器的数目“数出”目标序列的拷贝数。在实际的数字PCR实验中，事实上是通过呈现两种信号类型的反应器比例和数目进行统计学分析，计算出原始样本中的模板拷贝数。

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数字PCR技术的发展历史
从以上介绍我们可以看到，事实上数字PCR与传统的定量PCR两者皆定位于同样的平台基础——聚合酶链式反应和双链DNA标记技术，但两者采用的是完全不同的定量策略和思想方法， dPCR和qPCR并没有实验方法和思路上的承继关系，从这个角度来说，目前很多人把数字PCR称为第三代PCR技术并不准确。

在实时定量PCR技术成熟和发展之前，早在1992年，南澳洲弗林德斯医学中心的科学家使用有限稀释、PCR和泊松分布数据校正模型的方法（ limiting dilution, PCR and Poisson statistics），检测了复杂背景下低丰度的IgH重链突变基因，进行了极其精细的定量研究，虽然当时这种方法并没有被冠以“数字PCR”之名，但已经建立了数字PCR基本的实验流程，更重要的是了数字PCR检测中一个极其重要的原则——以“终点信号的有或无”（all-or-none end point ）作为判断标志，这也是之后1999年Bert Vogelstein 和 Ken Kinzler将之命名为“数字PCR”(digital PCR)的主要原因。

数字PCR技术的原理非常简单，然而在样品分散（divide）的环节上却遇到了无法突破的瓶颈。早期的dPCR尝试使用96孔板到384孔板甚至1536孔板作为分散反应的载体，或者采用类似流式技术的磁珠乳液扩增方法(BEAMing-Beads, Emulsion, Amplification, Magnetics)，2006年 Fluidigm公司推出了第一台商品化的基于芯片的商品化数字PCR系统。2008年德国 Inostics 推出基于磁珠法乳浊液扩增和流式检测方式的BEAMing dPCR 检测服务，但这些方法无论在分散程度和数据群体的体量上都无法达到更加精细的要求，时间和耗材成本严重限制了dPCR技术的发展。

近几年来，随着纳米制造技术和微流体技术（nanofabrication and microfluidics）的发展，数字PCR技术遇到了突破技术瓶颈的最佳契机。1997年Kalinina, 、Brown J, 和Silver J使用纳升级芯片进行单克隆模板PCR扩增，获得了美国专利，更重要的是这种采用“电浸润法”进行纳升级芯片制造技术显露雏形。伴随二代测序技术发展起来的“油包水PCR”技术，可以一次生成数万乃至数百万个纳升甚至皮升级别的单个油包水微滴，可以作为dPCR的样品分散载体。

QuantaLife 利用油包水微滴生成技术开发了微滴式数字PCR技术，这也是最早出现的相对成熟的数字PCR平台，在运行成本和实验结果稳定性方面都基本达到了商品化的标准。2011年，QuantaLife 公司被Bio-Rad公司收购，其微滴式数字PCR仪产品更名为QX100型号仪继续在市场上销售，这个早期型号为dPCR概念的普及和应用领域的拓展发挥了重要作用。2013年该公司又推出了升级型号QX200。

2012年，RainDance公司推出Raindrop型号数字PCR设备，这个设备将其原有的二代测序文库制备平台技术平移到数字PCR技术平台，在高压气体驱动下，将每个标准反应体系分割成包含100万至1000万个皮升级别微滴的反应乳液，该公司的创始人之一Darren Link表示这种超高的微滴数目可以为用户“提供更高的检测动态范围，适用于处理更大浓度差异的不同样品” 。

2013年下半年，Life-technologies推出了QuantStudio 3D数字PCR系统，这也是目前数字PCR市场上最新型号的产品。采用高密度的纳升流控芯片技术，样本均匀分配至20,000个单独的反应孔中。在整个工作流程中，样本之间保持完全隔离，可以有效地防止样品交叉污染，减少移液过程，简化操作步骤。同时芯片式设计避免了微滴式系统可能面临的管路堵塞问题。

作为Life-technologies在OpenArray芯片平台之外推出的全新的芯片式数字PCR系统，值得一提的是，这个全新的系统在设计理念上综合考虑了系统稳定性与运行成本因素，直接反映了该系统“适合所有分子生物学实验室使用的数字PCR系统”的市场定位。

数字PCR技术的应用领域
从上世纪90年代以来qPCR技术的爆发式发展使得现代核酸检测技术具有全新的面貌，而进入二十一世纪之后，速度更快、通量更高。成本更低的DNA测序技术正在迅速发展，也是目前竞争最为激烈的研究领域之一，即使在这种情况下，dPCR技术仍然以其高度的灵敏性和特异性在诸多科学领域争取到属于自己的一席之地。即使在一些传统的qPCR应用领域，也有一些实验室同时选择dPCR平台进行平行实验以保证实验结果的准确和可重复性。

在基因组变异研究领域，群体基因组水平上的SNP（Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性）检测面临的问题主要是突变序列往往与大量正常序列同时存在，竞争性反应严重影响突变序列的检测精度，数字PCR技术带来的极高的扩增特异性在稀有突变检测方面具有天然的优势，在癌症标志物检测、无创产前检查、线粒体突变检测等研究方向上，我们已经看到dPCR的许多精彩表现。

CNV（Copy Number Variations，拷贝数变异）研究需要极高的定量精度以区别不同拷贝数之间的微小差异，测序方法适用于高于30%的变异率检测，而qPCR的最高分辨在1.5倍左右，数字PCR通过直接计数目标基因与参照基因( 拷贝数为1的基因，例如RNaseP) 的数目，计算比值，直接得到目标基因的拷贝数可以达到极高的拷贝数分辨精度［5］。

除此之外，dPCR在病原微生物检测、microRNA研究、基因表达研究、NGS测序文库的绝对定量、表观遗传学直接相关的DNA甲基化定量检测、ChIP定量鉴定等领域的应用都令人极为期待，而在转基因成分鉴定、分子标准品精确定量、环境样本检测等具体的应用方向上，已经有大量实验数据和结果证明了dPCR技术的优良性能。

与传统qPCR技术相比，数字PCR技术具有极高的灵敏度、特异性和精确性，但截止目前而言，数字PCR对广大科研工作者仍然是一种全新的检测方法，我们在看待数字PCR的应用前景时，更应该保持一种开放的心态，与其说数字PCR技术是一个新的检测平台，不如把它视为一种全新的技术思路和手段，在这个平台上必将有更多的应用帮助我们深入到分子生物学研究的更高层次。

作者: wwwkkk83 时间: 2015-8-26 11:56
30年来，PCR技术就如同阿基米德拿来撬动地球的杠杆一样撬动了生命科学研究的每一个领域。30年，PCR技术刚好发展到了第三代：

第一代PCR就是常见的定性PCR技术，它采用普通PCR仪来对靶基因进行扩增，采用琼脂糖凝胶电泳来对产物进行分析。定性PCR有几个缺点：1)采用毒性较大的核酸染料，会对实验人员和环境造成伤害，2)容易发生污染而造成假阳性结果，3)检测耗时长，操作繁琐，4)只能定性检测产物的有无，而不能对起始模板量进行定量（如图一）。

图一：定性PCR仪

第二代PCR就是荧光定量PCR技术（Real-Time PCR，qPCR），荧光定量PCR诞生于1992年，它通过在反应体系中加入能指示反应进程的荧光试剂来实时监测扩增产物的积累，借助荧光曲线的Cq值来定量起始靶基因的浓度。荧光定量PCR需要借助校准物制备的标准曲线来定量，因此实际上是一种相对定量方法。而且不同厂家生成的仪器确定Cq值的方法不同，甚至同一个厂家还有多种确定Cq值的方法，实验者也可以根据自己的经验随意调节Cq值，这就直接造成了人与人之间、仪器与仪器间、实验室与实验室间的定量结果可比性差；荧光定量PCR也存在多个问题，如校准品和样品间背景不同而引入偏差、难以检测低拷贝数的靶DNA、样品与校准物的扩增效率不同、DNA提取中引人的杂质或DNA降解影响PCR的动态扩增等。（如图二）

图二：实时定量PCR仪

第三代PCR技术--数字PCR（Digital PCR，dPCR，Dig-PCR），是一种全新的对核酸进行检测和定量的方法。它采用直接计数目标分子而不再依赖任何校准物或外标，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。（如图三）

图三：数字PCR仪

Vogelstein和Kinzler第一次描述了数字PCR的概念，用于在大量正常细胞群中检测少数含突变的细胞（如结肠直肠癌的致癌基因）。通过稀释样品DNA到每两个检测孔中才有一个分子，经PCR扩增后，向每个孔中加入特异性结合突变型的荧光探针和既能与突变型结合也能与野生型结合的荧光探针与产物杂交，然后直接计数样本中突变型和野生型等位子的数量。数字PCR要通过使用统计分析（如贝叶斯估计）来评估等位基因分布同正常值不同的可能性强度，因此将传统PCR的指数的模拟信号转换成线性的数字信号。

数字PCR的灵敏度取决于分析中采用的检测孔的数目和聚合酶的固有突变率。在聚合酶的保真性难以提高很大的情况下，增加分析孔的数量可有效提高检测的灵敏度。现代数字PCR的发展趋势是采用微滴式方法替代传统的稀释方法，通过对样品进行微滴化处理，将含有核酸分子的反应体系分散成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理即可得出样品中靶分子的起始拷贝数。

数字PCR技术主要应用在以下几个方面：突变分析、评估组织内的等位基因失衡、体液DNA的癌症检测、混杂DNA的癌症检测、定量特异等位基因的基因表达等。

数字PCR反应流程示意图

数字PCR分析突变示意图

游引物F1和下游引物R1扩增的区域包含待检的突变位点。使用过量的引物R1，经不对称PCR扩增，产生可以同分子信标互补的单链DNA。绿色探针位于突变位点之外，因此既可以同野生型等位基因结合，也可同突变型等位基因结合。而红色探针只能识别和结合野生型等位基因。因此存在野生型DNA的孔能检测到红色荧光和绿色荧光两种荧光，而存在突变型DNA的孔检测到绿色荧光则相比红色荧光大大过量。

数字PCR评估等位基因失衡示意图

一对分子信标引物设计用来扩增一段约100bp的PCR产物，这段产物的中部包含一个单核苷酸多态性（SNP）位点。两个分子信标除了同SNP位点互补的碱基和标记的荧光分子外，完全相同。绿色和红色分别代表荧光素和hex标记。游离状态的分子信标的信号被3'-dabcyl基团猝灭而不发出荧光。当同互补序列杂交时，分子信标发出荧光。样品DNA被分配到384孔PCR板中，经PCR反应后，向每个孔中加入分子信标以确定等位基因状态。数字PCR和基于分子信标的等位基因鉴别也可整合到一步反应进行。

参考文献：
Pohl G, Shih le-M. (2004) Principle and applications of digital PCR. Expert Rev Mol Diagn 4(1):41-47
Vogelstein B, Kinzler K W. (1999) Digital PCR. Proc Natl Acad Sci USA 96:9236-9241
李亮, 隋志伟, 王晶, 臧超, 余笑波 (2012) 基于数字PCR的单分子DNA定量技术研究进展. 生物化学与生物物理进展 39(10):1017-1023

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