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标题:
急!救助Sf9细胞转染问题
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作者:
virology
时间:
2015-7-8 10:09
标题:
急!救助Sf9细胞转染问题
原贴由nk0401发表于 2010-8-9 11:28
http://biosky.haotui.com/thread-16069-1-6.html
本人最近再做转染。Bacmid是按照英俊说明书上手提方法提取的,溶液1,2,3等。
请问 1、提取1.5ml菌液的量够吗?
2、最后溶解时候用水好还是TE好?这样提出的DNA需要在纯化吗?我担心抑制转染效率。
3、转染我用Cellfectin,基本按照说明书做的。
请问细胞贴壁15min是不是时间有点短?
说3- 5h后换液,我试过6h和12h,目前还看不到病变,请问这个时间需要摸索吗?
说是1微克DNA和100微升无添加Grace混合,DNA的量怎么掌握?
我刚接触这个,问的问题可能不专业,希望大家给我点意见或建议,谢谢!
以下为会员回复:
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stare024 于 2010-8-9 12:10 :
转染贴壁细胞,以细胞贴壁完全,状态良好,密度合适为宜。不要拘泥于说明书上的时间。
加入细胞悬液15min后,有可能状态好,可以进行转染,
也有可能状态不好,最好不要转染。
提完DNA后转染都是要测浓度的,只要DNA足够量就可以。
你1管也是抽,2管也是抽,3管也是抽,干嘛一次抽一管,一次多抽点儿以备不测嘛。
用水溶解最好。
daniel 发表于 2010-8-9 12:22 :你的质粒的浓度和纯度都要达到要求,细胞状态和密度等都要在很好的状态下,我感觉你的DNA浓度不高,而且纯度不纯,都会影响你的转染效率,你转染的时候要测你质粒的浓度和纯度,才能掌握DNA的量。
我做转染的时候是前一天细胞铺板,第二天做转染,5h后换全培,有时候病变出的时间要在5-6天,其它条件还是要慢慢摸索,别着急 ,会转染成功的。
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nk0401 发表于 2010-8-9 15:28 :
To 2# stare024
我上次是抽了3ml,测的浓度是1微克/微升,260/280是1.98。转染的说明书是要求1微克,我试了1,2,3微克,换液时间有6h的,也有12h的。目前已经转染了2天了,没有什么变化。
nk0401 发表于 2010-8-9 15:32 :
To 3# daniel DNA的浓度是1微克/微升,260/280是1.98。我也担心15min时间不够,而且每次铺板后上面会有不少死细胞漂浮。请问你提前一天铺的话,铺多少细胞合适?比如6孔板。转染时候细胞大概有多少了?
作者:
virology
时间:
2015-7-8 10:12
158584843 发表于 2010-8-9 17:06 :如果第一次转染,到5天没看到病变,可以收集上清再接毒,看看有没有病变!盲传2次看看,再就PCR鉴定一下!
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daniel 发表于 2010-8-22 13:36
CR鉴定是否转染成功,需要提取上清中杆状病毒的DNA来进行鉴定
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wangting0823 发表于 2010-10-25 13:49 :我也正准备做sf9的转染,用的是invitrogen的cellfectinII
这里大家提到的病变和盲传是什么意思啊
PCR鉴定是怎么做呢?模板、引物之类的有什么特别吗
转染新手,请各位大虾赐教
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恋沙发表于 2010-11-7 18:17 :我使用的是Invitrogen的Bac to Bac 转染系统,我们实验室的做法如下:
1.用3mL的LB抽取bacmid后,使用Target DNA 的上游引物+M13R进行PCR验证
2.验证成功后,用150mL的LB大抽Bacmid,使用TE进行溶解,转染时的使用量为2ug
3.我们使用的是Roche的转染试剂,sf贴壁时间为1h,然后4~5h后进行换液
希望对你有所帮助~~
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