1.目的要求 植物病毒不能主动侵入寄主,但病毒病仍然十分普遍,这是与病毒侵染的机制和传播的有效性密切相关的。实验室中常用病株汁液作为人工接种的材料,可有效地将大多数病毒接种到试验材料上。但有些病毒则不能用汁液接种,必须用介体来传染,例如昆虫介体等,它们以不同的方式来传播病毒。不同的病毒有不同的传播方式,因此这也是病毒鉴定时的重要性状之一。 通过人工摩擦接种,学习常规的汁液接种法和关键技术,通过对一套鉴别寄主的接种,了解鉴别寄主的鉴别作用,筛选作用和定量作用。 通过蚜虫或叶蝉的传毒实验,学习利用介体传播病毒的技术,从而加深对介体作用的认识。 有些病毒材料在研磨过程中易被氧化而钝化,因此还要加入少量的缓冲液,常用的是0.01M的磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.2),有时还加有Na2SO4或巯基乙醇(0.1%)(Mercapioethanol),抗坏血酸等还原剂以保护病毒。 2.材料和用具 植物病毒标样1号,2号,3号,4—5叶期的心叶烟,普通烟、苋色藜、千日红、蚕豆和莱豆苗等,幼苗生长健壮,无 病虫害。 肥皂或肥皂水,消毒的研钵与研棒,洗瓶,金刚砂或硅藻土(600目),0.05MpH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS),塑料标签,铅笔,小毛笔,养虫笼,养虫罩,拟除虫菊酯,喷雾器、指形管、塑料封口膜,洗瓶。蚜虫(必须是不带任何病毒的健康的无翅蚜,尽量不用有翅蚜):桃赤蚜(Myzuspersicae);豆蚜(A.crassivora)和甘蓝蚜(Brevcorgne brassicae)等。 3.内容与方法 本帖隐藏的内容需要回复才可以浏览3.1人工摩擦接种 (1)因为每个人的手指甲和手指上都可能污染有多种病毒,因此在做实验之前都应先用肥皂水洗手,将病毒钝化和洗除干净,以防污染。 (2)供试植物叶面如有污物泥沙,应先用自来水冲洗干净,晾干后均匀地撒上摩擦.剂(金刚砂或硅藻土)。 (3)剪取小块病毒病样本的叶片放在研钵中,加入少量磷酸盐缓冲液,研碎成糨状。 (4)用食指或研棒蘸取少量病叶汁液,在供接种的植物叶面轻抹2—3次,注意摩擦要轻,不要来回擦,应单向地从叶基向叶尖方向抹,接种叶用手掌或手指托住,不要用力过大,更不能弄破叶片。 (5)接种后即可用洗瓶将叶面的病汁液和摩擦剂冲洗干净。注意:一定要将摩擦剂冲洗掉,否则将影响日后的症状观察(图9)。 (6)用铅笔在接种过的叶片尖端刺一小孔作为接补叶的记号。 (7)各组要用一盆植物作空白对照,即用缓冲液代替病R1汁液做接种。 (8)用铅笔写好标签后插入花盆中,标签要注明:病毒标样代号,寄主符号,接种日期和接种者。例如T1,心叶烟, 日/月, 张/刘。 (9)接过种的植物要放在有光照的温室中培养,每2—3天观察记载一次发病情况,尤其要注意接种叶和新叶上的症状是否相同? (10)为了提高接种的成功率,通常将待接种的植物幼苗放在黑暗处8—10小时后再接种。 (11)症状记载的常用符号:枯斑:11:坏死:Nl褪绿;Ch,斑驳;Mo,花叶:M,环斑:RS,脉明,Vc蕨 叶:F。 如连续三次观察的结果是: (1)接种叶枯斑,新叶无症状可记为II/一 (2)接种叶枯斑,新叶褪绿可记为ll/ch (3)接种叶枯斑,新叶花叶可记为1l/M 3.2 蚜虫饲毒接种 能传播病毒的媒介物很多,以刺吸式口器的昆虫为主,其次是真菌等。 (1)从隔离的养虫笼中收集无翅蚜,用振落法使蚜虫跌落到大培养皿或白磁盘中,用毛笔沾取蚜虫收集在指形管或三角瓶中,纱布封口,在20℃左右温箱中饥饿4—6小时。 (2)将病毒病叶摘下放在大培养皿中。 (3)取出饥饿的蚜虫,抖落在病叶上,蚜虫稍经爬行后立即停住取食(头朝下,尾部朝上).也可将蚜虫直接挑放在病株上饲毒。 (4)经取食5—10分钟或特定的时间后,用毛笔轻触蚜虫的尾部,使蚜虫拔出口针,然后用毛笔将蚜虫挑起,移放到待接种植株的心叶上,并用养虫罩罩住;也可将蚜虫挑放在特制的接虫纱罩(图10)中,然后将纱罩夹在供接种植株上部嫩叶的背面。植株放在温室中培养。 (5)24小时后喷撒杀虫剂杀死蚜虫,移去养虫罩或接虫纱罩。 (6)植物放在温室中培养。 (7)定期观察记载接种和新叶上的症状o 4.实验时间 3学时。 5.作业与思考题 (1)列表记载接种毒源在各鉴别寄主上的症状及发病过程,查阅有关资料,分析核对你接种样本可能是哪一种病毒? (2)为何一定要先洗手,后接种? (3)如何测定病毒/蚜虫是持久性传播还是非持久性传播(提出试验方案来)? (4)为何要用缓冲液?为何要有作空白对照的植株? (5)有些病毒人工接种不发病,可能有哪些原因? |
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