人类中的很多突变都与基因突变相关。例如，白化病是因为酪氨酸酶基因上的点突变导致酪氨酸酶功能异常，从而导致了黑色素合成障碍。还有一些病症涉及到多种基因突变导致的功能障碍。如果能够使用某种精确的基因编辑方法，修补这些基因突变，从理论上讲，就可以一定程度缓解病情。而人类T细胞的基因突变导致其功能异常，会导致很多病症的出现或者加重。针对T细胞的基因改造，对于癌症的免疫治疗、艾滋病、免疫缺陷病、自身免疫病，都可能会带来新的希望。美国加州旧金山的科学家们使用CRISPR/Cas9系统成功精确改造了人类T细胞基因组，相关进展发表在《美国科学院院刊》。他们利用Cas9对初级淋巴细胞的成功精确改造，是基因工程治疗真正用于疾病治疗的开端，具有里程碑式的意义。
针对T淋巴细胞的基因改造的设想早已提出，并且从理论上，科学家们认为改造T淋巴细胞可能可以用于癌症等多种疾病的治疗。然而，改造T淋巴细胞的基因组并非易事，只有很少的细胞能够完成基因组编辑。基因改造系统需要敲除T淋巴细胞内的一些基因，加入一些基因进入基因组，还需要修复一些突变的基因位点。最新的这个研究，使用Cas9系统，引起CXCR4蛋白的编码基因被随机插入碱基或者碱基丢失突变，而表达降低。这种CXCR4蛋白是HIV病毒识别T淋巴细胞的关键因子。而且，他们还使用Cas9系统精确引入碱基突变，可以在初级淋巴细胞中改造CXCR4和PD-1的基因。可以导致这两种蛋白质表达下降。PD-1蛋白的表达下降可以导致T淋巴细胞更好地识别恶性癌细胞，增加免疫系统的抗癌能力。实验使用的Cas9系统的核酸酶（RNPs）是在细胞外组装完成的，然后使用电击穿孔的方法，导致细胞膜增加通透性，核酸酶进入细胞后完成基因改造。
通过Cas9改造后，有大约40%的细胞CXCR4蛋白表达下调。使用深度测序的方法分析这些细胞的基因组发现，他们的Cas9改造实现了20%的基因编辑效率。即使用50pmol和100pmol的同源定向修复模板（HDR），分别可以到达22%和18%的细胞被成功改造并蛋白表达下降。这表明了这个系统可以很高效完成针对T淋巴细胞的基因组改造（基因敲除和基因嵌入）。针对改造成功和未成功改造的T淋巴细胞，使用针对低CXCR4表达量的特性选出那些基因编辑过的细胞。富集之后的细胞，通过某些处理，再重新导入人体，可能可以作为抗肿瘤或者艾滋病的新的免疫治疗方法。
使用Cas9系统针对T淋巴细胞基因组的精确改造，比起针对胚胎的基因改造的伦理问题更小。因为，改造的这些细胞一般不会传递到下一代，因此审核不会太严格。此外，还有很多医药公司等着这样的基因改造，而针对T淋巴细胞改造后设法输入人体的研究已经有了很多的技术积累。这个研究的作者们认为，在更加严谨地完成基因改造和充分考虑安全性之后，就可以很快用于临床的实验，因此在治疗癌症、艾滋病和自身免疫病等领域将会有着非常光明的前景。（生物谷Bioon.com）
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Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins
T-cell genome engineering holds great promise for cell-based therapies for cancer, HIV, primary immune deficiencies, and autoimmune diseases, but genetic manipulation of human T cells has been challenging. Improved tools are needed to efficiently “knock out” genes and “knock in” targeted genome modifications to modulate T-cell function and correct disease-associated mutations. CRISPR/Cas9 technology is facilitating genome engineering in many cell types, but in human T cells its efficiency has been limited and it has not yet proven useful for targeted nucleotide replacements. Here we report efficient genome engineering in human CD4+ T cells using Cas9:single-guide RNA ribonucleoproteins (Cas9 RNPs). Cas9 RNPs allowed ablation of CXCR4, a coreceptor for HIV entry. Cas9 RNP electroporation caused up to ∼40% of cells to lose high-level cell-surface expression of CXCR4, and edited cells could be enriched by sorting based on low CXCR4 expression. Importantly, Cas9 RNPs paired with homology-directed repair template oligonucleotides generated a high frequency of targeted genome modifications in primary T cells. Targeted nucleotide replacement was achieved in CXCR4 and PD-1 (PDCD1), a regulator of T-cell exhaustion that is a validated target for tumor immunotherapy. Deep sequencing of a target site confirmed that Cas9 RNPs generated knock-in genome modifications with up to ∼20% efficiency, which accounted for up to approximately one-third of total editing events. These results establish Cas9 RNP technology for diverse experimental and therapeutic genome engineering applications in primary human T cells.
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