中国病毒学论坛|我们一直在坚持！

标题: [转移贴]细胞培养上清的浓缩方法 [打印本页]

作者: hantavirus 时间: 2015-8-5 09:18
标题: [转移贴]细胞培养上清的浓缩方法
原贴由炅沅发表于 2010-9-25 07:28

谁知道反转录RNA病毒的细胞培养上清液的浓缩方法有哪些？（尽量越浓越好，最好100ml能够浓缩为1ml）谢谢了！

作者: hantavirus 时间: 2015-8-5 09:18
半拉木匠发表于 2010-9-25 08:58 ：

不知道楼主浓缩的目的是什么？病毒在上清里？浓缩后要活病毒还是要死病毒？要活病毒的话就不知道怎么弄了要是要死病毒的话找合适分子量的半透膜（透析袋）做无菌处理（NaOH ddH2O）后PEG浓缩或者直接将切向流膜包无菌处理后在超净台内浓缩。

作者: hantavirus 时间: 2015-8-5 09:20
炅沅发表于 2010-9-25 09:18：

浓缩的目的是让病毒量高一点，因为部分病毒会在上清中，所以浓缩后的上清中病毒含量高！用于免疫的，应该是死细胞！能将具体的步骤给我说一下吗？谢谢版主了

作者: hantavirus 时间: 2015-8-5 09:22
hwqstrong 发表于 2010-9-25 13:38 ：

MILLIPORE超滤膜包最简单
如果想要活病毒，可以控制温度或者加快时间

作者: hantavirus 时间: 2015-8-5 12:05
半拉木匠发表于 2010-9-25 16:26 ：

To 炅沅

其实楼下大家所说的不失为更好的方法，如果老板允许你买器材的话。
1.       根据你要截流的目的物的分子量选择合适孔径的浓缩装置（膜包、浓缩杯等）那些新买到的东西本身都是经过无菌处理的，直接使用即可，简单方便。
2.       不花钱的土办法：买或者讨要些透析袋，学名叫透析膜，常用的是美国联合碳化合物公司（Union Carbide）和美国光谱医学公司生产的商品化的东西叫透析管。截流分子量一般是10KD。
2.1.       杂质去除：50%乙醇煮沸1小时；0.01M NaHCO3洗涤、浸泡半小时；0.001M EDTA洗涤、浸泡半小时；纯化水洗涤浸泡半小时以上。除杂质很重要（具体参看《分子克隆》）
2.2.       消毒灭菌：
2.2.1.       配制0.1M NaOH，配制后121℃30min 高压灭菌或者找耐碱膜0.22/45um过滤。保存于无菌密闭容器后置超净台内。
2.2.2.       将除杂质后的透析管浸泡于无菌0.1M NaOH溶液内4小时以上。
2.2.3.       配制灭菌注射用水，方便的话就配PBS（中性配方即可）灭菌。
2.2.4.       高压灭菌几把镊子或者止血钳（包裹高压）
2.2.5.       此后全在超净台内无菌操作__________________________
2.2.6.       使用灭菌镊子取出透析管于超净台内用大量灭菌注射用水或灭菌PBS冲洗，除去NaOH.（拿试纸粗检流出液OH即可知NaOH是否去除）
2.2.7.       将透析管一端用止血钳夹死活用线绳扎死。从另一端将目的物注入后同样封口
2.2.8.       取PEG6000置平皿内（无法保证无菌）
2.2.9.       将透析袋两端轧口处悬起，使袋体接触PEG（跟吃烤牛肉蘸调料差不多，浓缩速度不是很快，最好自己做个合适的架子要不胳膊受不了、每隔约0.5~1小时翻转一下就行） 20ml做10倍浓缩（体积是估计出来的）大概3小时吧。
2.2.10.       浓缩完成后将目的物吸出即可。
2.3.       注意事项：
2.3.1.1.       透析袋出液口封轧很关键，最好用止血钳，操作才方便，要是线绳、皮筋之类的不好控制无菌。
2.3.1.2.       浓缩过程中切忌保证出液口不能接触PEG，一旦进入接口处无法去除，即便不产生细菌污染也会产生PEG污染，用灭菌水/PBS冲洗也不一定彻底。
2.3.1.3.       使用过的透析装置或者超滤装置也可以采用以上NaOH的方法重复使用。
如果觉得浓缩后目的物离子浓度抬高就在把它挂在自己想用的溶液内透析就行了，形如吊炉烤鸭，出液口悬在液面外防止污染即可。

欢迎光临中国病毒学论坛|我们一直在坚持！ (http://bbs.virology.com.cn/)