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标题: [转移贴]HBV 复制中间体 [打印本页]

作者: hantavirus 时间: 2015-8-28 13:46
标题: [转移贴]HBV 复制中间体
原帖由紫色血儿发表于 2009-8-26 23:27

有哪位同仁在做HBV表型耐药吗？有什么好的复制中间体提取方法吗？谢谢！

作者: hantavirus 时间: 2015-8-28 13:47
bigben发表于 2009-8-28 15:37 ：

复制中间体？cccDNA？

作者: hantavirus 时间: 2015-8-28 13:48
yaoming发表于 2009-9-7 22:11 ：

给你一个我的提取复制中间体的protocol，很好用的:
1)细胞转染后2～3天，弃去培养上清，以预冷的PBS洗两遍，每60 mm培养皿加入400 ul NP-40 lysis buffer, 37℃静置10～20 min；
2)将裂解物移入1.5 ml离心管中，Vortex 1min，然后14,000 g离心 5 min，收集上清（包含core particle）；
3)往上清中加入1 M MgOAc，6 ul，5 mg/ml DNase I，12 ul，10 mg/ml RNase A，6 ul，37℃，30 min，充分去除细胞DNA和RNA；
4)14,000 g离心 1 min，收集上清（包含core particle），往上清中加入0.5 M EDTA 16 ul终止消化反应，再加入35% PEG8000，65ul，1.75 M NaCl，65ul，冰浴至少1 h，14,000 g离心 1 0 min后弃净上清，留下pellet（包含core particle）；
5)往pellet中加入100 ul DNase I溶液，37℃，30 min，充分去除残留的质粒DNA(如果是从HepG2.215等HBV整合细胞中抽提，不需要此步骤，直接进行下一步)；
6）再加入300 ul SDS/蛋白酶K溶液，37℃，12h以上（overnight）；
7)加入等体积的饱和酚，充分震摇，12,000 g离心10分钟，收集上清；
8)往上清中加入等体积的酚/氯仿（1：1），充分震摇，12,000 g离心10分钟，收集上清；
9)往上清中加入1/10体积的3 M NaAc（Ph 5.2）和两倍体积的无水乙醇，－70℃ 放置2 h或－20℃过夜，15,000g离心15分钟沉淀核酸，小心倾去上清，瞬间离心，小心吸取残留液；
10)室温干燥5～10分钟后，加入20 ul双蒸水。

实验有什么具体问题再问我吧！

作者: hantavirus 时间: 2015-8-28 13:50
xray19发表于 2010-6-25 20:54：

关于第5步，为什么加入DNase1消化再次去除质粒DNA？第3步的DNase1消化难道不能去除质粒DNA吗？
谢谢yaoming

另外，您所理解的复制中间体是什么？病毒颗粒中的rcDNA吗？

作者: hantavirus 时间: 2015-8-28 13:53
yaoming发表于 2010-6-28 13:27：

to xray19

是的，第三步主要是去除细胞的，要知道痕量的质粒污染对接下来的实验会造成很大误差和杂带很多，所以最后还要处理一下。

作者: hantavirus 时间: 2015-8-28 14:08
xray19发表于 2010-8-25 23:27 ：

再次请教yaoming，MgOAc的ph值有要求吗？它的作用主要是什么，有些文献上采用Mgcl2和cacl2，有区别吗？

35%的peg8000用什么溶液配制？水还是PBS?

谢谢！

作者: hantavirus 时间: 2015-8-28 14:09
yaoming发表于 2010-8-26 22:18 ：

回楼上

其实Mg和Ca离子无非就是DNA酶和RNA酶的激活剂。
35%的peg8000用水配制就可以了，不溶的话可以适当加点热。

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