8 P" Z+ h$ d, M5 v常规之选 2 r' H7 d( I; Y9 T# R T ' S' D! D' E2 ?0 \研究人员主要使用三种染料来处理日常的蛋白凝胶：考马斯蓝、银染和荧光。据Sigma-Aldrich公司蛋白技术的高级研发经理Jeffrey Turner介绍，染料的选择基本上可以归结为“灵敏度 vs. 速度”。 9 n$ j8 U2 D' o考马斯蓝也许是最常用的染料。作为一种可见的显色（亮蓝色）染料，它不需要任何特殊的设备。不过，Bio-Rad的业务开发经理Ning Liu认为，它的灵敏度也最低，检测极限大约在10-100 ng蛋白质。& B5 o3 \$ g1 z. `" I
) K H* F4 N; ?3 Y& S5 e很多公司提供不同配方的考马斯蓝染料，它们在使用简便程度、整体染色时间和脱色要求上各有不同。例如，有些需要在乙醇/乙酸中固定，而有些只使用纯水。Expedeon的InstantBlue™试剂可在电泳后直接添加到凝胶中，而不需要固定或脱色，染色可在15分钟内完成。Bio-Rad的QC Colloidal Coomassie Stain操作则建议慢慢来，以便达到更好的效果。整个过程包括在40%乙醇/10%乙酸中固定15分钟，之后染色1-20个小时，再脱色1-3小时。: P% Z; R( V: Z- c
有了赛默飞世尔最新推出的Pierce™ Power Stainer，研究人员可以让考马斯蓝染色自动化。据它的产品经理Emily Goplen介绍，这台设备可对两块凝胶进行染色和脱色。“尽管传统的染色需要几小时甚至过夜，Power Stainer却能在10分钟内完成染色和脱色的过程，并且预制胶和自制胶都适用，”她说。 4 n) n4 L: C/ \5 v3 y ?: ? " f$ W- f5 y+ N. k3 T9 N2 T另一种常用方法是银染，每条带的灵敏度大约在0.1-0.25 ng。操作过程没有脱色步骤，但是一个很长的过程，大约在2小时左右，而且相当讲究。此外，据Turner介绍，操作需要用到一些有害的化学物质，如甲醛和银，最好在通风橱中进行。因此，人们一般不大愿意用这种方法，除非灵敏度很重要。 & g3 B. [8 j* J8 p" i" e: {- h0 s! n) p5 X
荧光染料的灵敏度则居中，可检测几纳克的蛋白质，不过你得有一个兼容的凝胶成像系统或透射仪。与考马斯蓝和银染一样，荧光染色通常在电泳后进行，需要固定和脱色，不过也有例外。例如，SYPRO Ruby需要脱色，但Oriole和Flamingo不需要，因为游离的染料不发荧光。“染料本身不会被激光激发，只有当它与蛋白结合时才被激发，”Liu解释道。 - P6 [% H3 a [* t) s' h4 l3 _ ' c& z" t- A! P; m5 C! D. O R除了这些常规的染料，你还有一些特殊的选择。例如，赛默飞世尔为糖基化和磷酸化的蛋白提供了Pro-Q荧光染料，同时也提供InVision™ His-tag In-gel Stain和Lumio™ Green Detection Kit来检测带标签的蛋白。) ~0 |) ~; w( L% V9 x- G
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有些染料则让你省去了电泳后的洗涤和染色。比如，Bio-Rad的Stain-Free™预制胶预加了一种与色氨酸结合的“三卤”荧光染料。电泳后，凝胶暴露在紫外线下会激活染料，使其与蛋白质共价结合。据介绍，这种染料的灵敏度与考马斯蓝差不多。 5 P p A" [$ ]& I% t) U3 B3 N! M) C$ x* [/ i
另一个选择是GE Healthcare的Amersham™ WB系统。有了这个系统，样品在电泳之前与Cy 5荧光基团偶联。据GE Healthcare的资深科学家Åsa Hagner McWhirter介绍，在电泳过程中，游离的染料会跑出凝胶，因此没必要脱色，而且灵敏度在50-100 pg的范围。更方便的是，这个系统在电泳结束后自动对凝胶成像并分析结果。 % B- {- b$ b, J: D2 _- U! N 5 ~* }. u7 }; h3 {# s: g+ ILiu和McWhirter都指出，电泳前染色的方法有一个明显的优点，就是染料与分离后的蛋白共价结合。因此，在后续的步骤中能够观察这些蛋白，特别是在Western blot中，可利用总蛋白的信号来标准化目标蛋白的信号，而不像平常那样用看家蛋白。+ \8 H0 R) m n- ]3 O
! k& E- a( `% N6 e( r. } |* s4 C“这种方法明显消除了人们对看家蛋白对照的两个担心，”Liu表示。第一，在不同的实验条件下，看家蛋白的水平有时候会变化。其次，它们的水平可能超出了检测的线性动态范围，使得定量变得复杂。《The Journal of Biological Chemistry》杂志也建议使用总蛋白水平来进行信号强度的标准化。 0 l+ ~1 k2 k5 _- E/ f P L. v$ o! A; j
McWhirter认为，预标记也明显提高了凝胶之间的重复性，因为洗涤和染色的步骤难以精确控制。“不同反应间的CV要比在不同溶液中孵育凝胶要低得多，”她指出。事实上，她声称在内部分析14个样品时，Cy5信号的CV大约在5%。“这基本上和移液误差差不多。”2 H) P! A6 _0 {& z+ ^% t
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无论你选择哪种染料，在考虑灵敏度、速度和硬件要求外，你还要考虑下游怎么处理凝胶。若是印迹杂交，研究人员通常不用考马斯蓝染色，因为染料需要固定的步骤，会将蛋白困在凝胶里。他们要么平行跑一块相同的胶，要么在转印之后对印迹膜染色。同样，与蛋白共价结合的染料有可能干扰抗体结合或质谱分析。 * ~$ h$ `; u' } + a( d% l5 r6 b( t5 B' {3 s当然，并没有一个放之四海而皆准的解决方案。考马斯蓝是大多数研究人员的首选染色，但在特殊情况出现时，我们还是有很多其他的选择。+ e' k6 t: M9 z4 ]0 K( G
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