反应器细胞培养技术在疫苗生产中的应用和发展

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反应器细胞培养技术在疫苗生产中的应用和发展

王建超、张韧、陈文庆、阎杰

北京天和瑞生物科技有限公司，北京 102200

（来源：第十次全国生物制品学术会议论文汇编 2008-2009）

摘要   我国疫苗市场正迅速发展，疫苗生产技术也正经历着一场深刻的技术革新：从大规模转瓶培养动物细胞疫苗工艺技术向生物反应器培养动物细胞疫苗工艺技术的转变。这种疫苗工艺技术的转变，合乎世界生物制药发展趋势，也表明我国疫苗生产技术正逐步与世界生物制药技术发展主流接轨。反应器细胞培养技术不仅提高我国疫苗生产工艺水平和疫苗质量，推动生物反应器、反应器细胞培养技术在我国疫苗行业中的研发应用和技术发展，将促使我国从疫苗生产大国向疫苗生产强国的发展。本文从反应器细胞培养技术的历史发展、应用现状、关键技术因素，以及核心设备——生物反应器的发展、应用等方面进行了综述，分析并探讨了国产生物反应器以及反应器细胞培养技术在我国疫苗生产中的应用前景。

    我国是世界疫苗产品的最大使用国和最大生产国。因为SARS、流感、禽流感、蓝耳病等疾病的发生，我国疫苗市场增长迅速，每年以平均15％的速度递增，远远高于全球10%的水平, 预计到2012年包括兽用疫苗在内的中国疫苗市场规模可超过100亿元。目前人用、兽用等疫苗生产企业近百家，疫苗品种数量与发达国家差距较小，但关键生产工艺以及部分疫苗质量存在较大差距。涉及动物细胞培养生产的疫苗，大部分疫苗生产企业采用的转瓶培养动物细胞，因不同转瓶是一个独立的细胞培养单元，每瓶的细胞质量、病毒产量和滴度都不同，导致疫苗批间差大，而且操作劳动强度大，隐性污染引起高内毒素等缺点。

    我国政府高度重视疫苗在疾病防治中的作用，国家政策和科研基金等对企业疫苗生产和研发工作给予重要的支持。我国扩大了国家计划免疫规划范围，将甲肝、流脑等15种可以通过接种疫苗有效预防的传染病纳入国家免疫规划。口蹄疫、蓝耳病、禽流感、猪瘟、狂犬病等动物疾病疫苗都纳入了国家强制性免疫计划。另外，科技部和发改委在“863”计划、重大新药创制国家重大科技专项、国家科技支撑等计划中，对疫苗的研究开发与产业化都做出了重点安排和支持。

    中国具有人口优势，经济也在迅猛的增长，农牧副业也保持良好的发展势头。谁能掌握和应用不断发展创新的疫苗生产技术，谁才能在市场中脱颖而出并持续发展。这就需要国内生物制药企业要加强在疫苗生产关键技术的创新和应用，比如使用适合疫苗生产的个性化培养基，严格控制原材料的品质；升级自身的疫苗生产工艺，采用先进的反应器悬浮培养细胞工艺，提高生产效率，增强生物制品的安全性和有效性。

    本文将从疫苗生产过程的关键生产技术——反应器培养动物细胞技术在疫苗生产中的发展历史、应用现状、关键技术因素及未来发展等内容做一综述。

1 反应器细胞培养技术的发展及趋势

    1962年Capstile成功地大规模悬浮培养BHK21细胞，以及1967年Van Wezel成功应用微载体培养贴壁动物细胞，标志着反应器培养动物细胞技术的起步[1]。20世纪70年代起， 2000－5000L的反应器悬浮培养BHK21细胞开始应用于口蹄疫疫苗的生产中。进入80和90年代，在细胞融合技术和基因工程技术等生物技术发展的基础上，抗体药物迅速发展，极大地推进反应器细胞培养技术在生物制药中应用。2008年，抗体类药物的年销售额将达到200亿美元，占生物技术药物市场的1/3，上万升的动物细胞反应器培养规模和先进的流加培养工艺技术的应用都首先是在抗体生产中获得突破。目前，2000L－10000L生物反应器在生物制药中的应用已非常普遍，单抗生产的反应器规模已经达到20000L－25000L。2006年，全球生产型动物细胞培养反应器的总规模为197万升，动物细胞培养反应器体积还在不断增加： 瑞士龙沙、葛兰素史克等生物大公司都分别在新加坡建设上万升的动物细胞反应器生产线。有关资料预计，全球生物制药行业的生物反应器使用率将从2005年的60% 增长到2011年的85%。随着生物反应器在生物制药中的广泛应用，反应器细胞培养技术也变得更为成熟，包括流加培养技术、灌注培养技术、细胞代谢分析技术、细胞密度在线检测技术、低血清细胞培养技术及无血清细胞培养基的应用等 [2]。

    反应器细胞培养技术是以反应器悬浮培养动物细胞生产或研制生物制品的一种通用的平台技术，可广泛地用于生产单抗、人用疫苗或者兽药疫苗等生物制品。国内人用和兽用疫苗生产企业有100多家，但只有5家左右企业是采用反应器细胞培养技术生产疫苗，如辽宁成大和广州诺诚分别采用30L和14L进口反应器生产人狂犬病疫苗、南京梅里亚300L反应器生产禽苗，金宇集团650L/1200L国产CLAVORUSTM反应器生产口蹄疫疫苗。其他超过95%的疫苗企业生产仍然采用批量小、效率低、劳动强度大、占用场地多的转瓶机，生产应用的细胞培养基是50年代开发的MEM、DMEM、199、PRMI1640等基础培养基，血清添加比例10％左右，细胞培养和病毒生产效率低。其中的部分疫苗生产企业已感觉到反应器细胞培养技术是个重要的发展趋势，开始重视和研发反应器细胞培养技术，但基本处于研发阶段，距离产业化的反应器生产工艺尚有较大差距。我国的治疗性抗体总体上处于起步阶段，所用的无血清培养基和生物反应器均进口为主，比如北京百泰和上海中信国健等。

    从当前动物细胞大规模培养的发展趋势来看，反应器悬浮培养动物细胞技术、无血清培养技术等是当前世界范围内各大生物公司产业化生产疫苗等生物制品的首要选择和发展方向。反应器悬浮培养细胞、无血清培养在大规模疫苗生产中能提高单位制品产量、细胞高密度培养及表达、简化生产工艺、降低生产成本、保证大规模生产的制品质量等方面都起到非常重要的作用，是目前世界各大生物公司竞相开发的前沿课题。美国FDA和我国SFDA都鼓励和要求各生物公司建立起规模化、自动化的疫苗生产技术平台，从而提高和保证疫苗质量。

    因为疫苗产品的竞争实质是不同企业在其核心技术基础上的疫苗质量之争，谁在未来掌握了反应器疫苗生产工艺技术以及生产平台，提高了效力和安全性等疫苗质量，谁将会下一轮行业发展中掌握市场主动权。

2 动物细胞培养反应器是关键设备

    疫苗生产过程中应用到的动物细胞基质主要分为两类：贴壁培养型细胞和悬浮培养型细胞，并且以贴壁培养型细胞为主，比如Vero等传代细胞和2BS、KMB17等二倍体细胞。悬浮培养型细胞也是从贴壁培养型细胞发展而来的，经过细胞在悬浮培养基中的驯化或筛选，适应于悬浮培养环境，比如BHK21细胞、CHO细胞等。根据细胞的特点，反应器细胞培养也分为两种：悬浮培养和微载体悬浮培养。在动物细胞的培养过程中，细胞培养反应器是整个疫苗生产过程的关键设备，它要为细胞提供适宜的生长环境，决定着所培养细胞的质量和产量，影响着疫苗的生产效率和产品质量。

    动物细胞与微生物细胞有很大不同，没有细胞壁，比较脆弱，对剪切敏感，因此，对体外培养环境的要求更为严格，传统的微生物反应器不能用于动物细胞的大规模培养。动物细胞培养用生物反应器应遵循一些基本原则：严密的结构实现反应器长期的无菌性要求、低剪切基础上良好的流体混合性实现高效的传质和传热要求、可靠的检测和控制系统具有良好的稳定性等。

    细胞培养反应器可简单地分为机械搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、中空纤维生物反应器以及抛弃式的一次性生物反应器等。目前，超过70％的动物细胞反应器是机械搅拌式生物反应器，而且细胞培养的最大规模已经放大到25000升。机械搅拌式生物反应器主要由罐体、电机和电子控制器等部分组成。实验室研究用的台式反应器（Bench bioreactor），罐体一般是玻璃的，疫苗或者抗体等工业化应用的罐体则由是不锈钢制造的。搅拌由顶端或底部的电机来驱动，能获得良好的混合和传质效果。罐体顶端或侧面的在线传感器，连接着控制器，可以连续测定罐体培养液的温度、pH值、溶氧（dissolve oxygen，DO）等参数，并通过计算机程序实现在线检测和控制。对于几升的玻璃罐，可以用高压锅灭菌；对于几十升、上百升及上千升以上的不锈钢罐，一般采用在线清洗（clean in place,CIP）和原位灭菌(sterilization in place, SIP)装置实现反应器的清洗和灭菌。搅拌式生物反应器的主要优点是，结构相对简单，既可用于悬浮培养，也适用于微载体培养，细胞培养工艺放大相对容易，产品质量稳定，非常适合于工厂化生产生物制品。但其机械搅拌会产生一定剪切力，可能对细胞造成的损伤，不过在实践应用中可通过改变搅拌桨叶形状、细胞培养基的改进等措施来解决。此外，动物细胞培养反应器的大型化、自动化和精巧化也成为大家关注的问题。

    自从八十年代初起，我国华东理工大学、中科院等有关科研院所就开始动物细胞培养反应器研究及应用，但都停留在实验室研究阶段，一直都未能实现产业化生产。因为长期反应器细胞培养技术被我国生物制药企业认为是很困难、甚至是高不可及的技术，导致我国反应器细胞规模长期停留在2～30L规模，100L的动物细胞培养技术还不稳定，长期以来都是照抄照搬国外的技术和进口国外设备。国内反应器制造厂家也只能生产一些低档的发酵装置，仅靠对国外科研成果的模仿和基础科学的跟踪[3]。

    2008年起，北京天和瑞生物科技有限公司连续推出CLAVORUSTM120L、CLAVORUSTM 650L、CLAVORUSTM1200L动物细胞培养反应器，并在疫苗行业得到了成功应用[4]，从而打破了我国动物细胞反应器完全依赖进口的局面，促进了我国疫苗等生物制药行业的技术升级。国产动物细胞反应器相比于进口反应器，无论从反应器质量控制、反应器配件提供、反应器供货速度等方面，还是在反应器工艺技术支持等方面，都有显著的优势，并从细胞培养工艺放大上解决了我国生物技术产业化种最薄弱的技术环节——动物细胞大规模培养技术的装备技术支撑问题,有利地推进了我国疫苗生产企业从大规模转瓶培养动物细胞疫苗工艺技术向生物反应器培养动物细胞疫苗工艺技术的转变。而这种疫苗工艺技术的转变，合乎世界生物制药发展趋势，也表明我国疫苗等生产技术正逐步与世界生物制药技术发展主流接轨。可以预料未来几年生物反应器在我国疫苗行业的使用率将有一个大幅的提高。

3 反应器细胞培养技术需要个性化细胞培养基

    由于不同细胞的营养要求往往是特异性的，但一般市售的细胞培养基很难满足动物细胞在反应器中大规模、高密度生长时的营养要求。对细胞无血清培养而言，细胞的营养要求还具有克隆特异性，更需要与细胞相对应的个性化培养基。另外，在延滞期、对数生长期、稳定期等细胞培养的不同阶段，营养代谢也不尽相同，可根据不同反应器细胞培养工艺的具体特点，在反应器细胞培养的不同阶段，采用相应的个性化细胞培养基，能提高目标产物表达，增加产物产量和稳定性。因此，欧洲动物细胞培养协会主席Wurm博士曾说，培养基虽不是细胞培养中唯一重要因素，但确实是最重要的一种；将来反应器动物细胞培养技术进步的核心是培养基，而非特殊反应器或细胞系工程[5]。提高反应器生产效率的最直接、有效的手段就是研发与细胞营养需求、反应器工艺特点相符合的个性化细胞培养基。个性化培养基在国外生物制药企业被普遍采用，世界著名的生物制药公司（Amgen、Genetech）往往和培养基企业合作，研制最适合自身细胞特点的个性化细胞培养基。例如某知名国际品牌定制的个性化培养基占其培养基业务的93%，而其在中国销售的产品全部是目录产品。

4 反应器细胞培养技术的过程因素[6、7、8、9]

        由于动物细胞无细胞壁，对营养要求严格，培养基中血清的使用、乳酸/氨等副产物的积累、对pH、溶氧、温度、剪切应力、渗透压等环境因子的高敏感性等问题一直是动物细胞大规模培养的关键技术因素。大规模培养动物细胞是一项复杂而且经验性很强的工作，保证培养环境的无毒、无菌，防止污染是进行大规模培养的前提。因此，与细胞接触的细胞培养基、储液罐等材料或器具，均应严格清洗和灭菌；细胞培养过程所需的气体、液体，均应0.2µm除菌处理。反应器细胞培养技术要考虑反应器细胞培养环境的控制、细胞培养工艺的选择、个性化细胞培养基的选择、细胞培养工艺的过程放大及过程技术研究（Process Development）等。

    pH值控制对于大规模培养动物细胞非常重要，动物细胞的pH范围一般在6.8-7.4之间，低于6.8或高于7.4的pH值，都会对细胞产生不利的影响。细胞培养过程中葡萄糖代谢的副产物乳酸的产生，以及细胞代谢呼出的CO2逐渐积累于培养液中，使得pH值不断下降。维持pH值最常用的办法通常是补加NaHCO3、NaOH、选择有较好缓冲能力的细胞培养基或者稳定培养液中CO2浓度等。

    如何维持一定的溶氧（DO）浓度而不损害细胞是动物细胞大规模培养中的一大难题。细胞在缺氧条件下不能生存，溶氧过低会影响细胞代谢，从而影响细胞的生长；溶氧过高时也会对细胞产生毒性作用，抑制细胞生长。细胞在不同生长阶段，对氧的需求是不一样的，对数生长期细胞的耗氧能力就特别强。一般大规模培养过程的溶氧浓度控制在20％－60％的空气饱和度。调节供气中的空气、氧气和氮气比例，或者增加搅拌转速等方法均可维持一定的溶氧浓度。

    细胞培养温度通常为35-37℃， 高于此温度会造成细胞生长的停滞和细胞死亡，低于此温度会降低细胞生长速度和影响产品的表达和质量。但总的来说，培养细胞对低温的耐受力比对高温的耐受力强，在反应器的参数调整过程中需防止温度窜得过高。在选择反应器过程中，对于温度控制的精度等都需要加以考虑。

    大多数动物细胞的适宜渗透压范围是在280－330mOsm/kg H2O左右。动物细胞大规模过程，随着乳酸等副产物的产生，加入NaHCO3控制pH值等因素，或者流加培养过程高浓度营养浓缩液的添加，均会导致渗透压升高；在细胞高密度培养中，渗透压的增加尤其突出，有时会高达400mOsm/kg H2O以上，可能导致细胞迅速死亡。

    无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，反应器细胞培养工艺就操作方式而言，主要有批培养(batch)，流加培养（fed-batch)和灌注培养(perfusion)等方式。具体操作方式的选择主要考察以下几个因素：细胞株性能、产物表达量和稳定性、培养基或添加物的选择、目标产物的分离纯化难度以及是否最终培养体积等。

    反应器细胞培养工艺放大对于疫苗生产过程的成本降低、产量提高具有非常重要的意义。就如工业经济学中企业生产的“规模经济”概念，即企业维持合适的生产规模，企业管理效率高，生产成本较低，产品具有非常强的市场竞争能力。相对于微生物而言，动物细胞培养生产的病毒或者蛋白质的产量通常都很低，所以产品的生产成本高，降低成本是要考虑的主要问题。除了优化生产工艺、提高产品浓度外，降低生产成本的重要办法是扩大生产规模，即提高反应器细胞培养规模，产品的生产成本随细胞培养生物反应器的体积增大而降低。以狂犬疫苗生产为例，一个120L反应器培养Vero细胞及生产狂犬病毒的效率比得上3－4个30L反应器；一个650L反应器生产工艺就及得上25－30个30L反应器。一般而言，10000－15000L的反应器培养规模是比较合适的，进一步增加反应器体积时对产品成本的降低已经不是十分明显，而此时工艺放大却变得更为困难、发生污染造成的损失也非常大。从概率上讲，随着反应器规模的逐渐放大，发生污染的机会也增加。但二十年的反应器生产实践证明[10]，执行严格的GMP过程管理、SOP操作及验证工作，反应器污染发生率一般低于5％，甚至不发生污染。

5 反应器细胞培养技术的应用前景

    随着法规对生物制品的安全性、稳定性等质量要求的提高，疫苗行业竞争的加剧，许多疫苗生产企业都意识到，建立起企业长期的产品优势、成本优势等竞争优势，就需建立起包括反应器细胞培养技术在内的生物制药支撑技术体系，加强技术创新研究和应用，不断发展和巩固企业的核心技术优势。当前，许多疫苗生产企业非常重视疫苗工艺的技术革新，将反应器细胞培养技术列入企业的重要研究课题，与反应器工艺技术研发企业加强了生物制药支撑技术的开发合作、战略合作，进行多形式、多层次的合同研究（Contract Research Organization, CRO）、合同制造（Contract Manufacturing Organization, CMO）等合作。通过合作，疫苗生产企业可快速掌握反应器细胞培养技术，并在这一支撑技术基础上方便地构建自己先进的产品生产工艺，发展自身的产品和生产技术，节约新产品研发时间，控制和减少风险，快速提升企业核心竞争实力。国内已有企业根据疫苗行业的常用细胞系，分别建立了不同规模的反应器培养Vero细胞、CHO细胞、BHK21细胞、Marc145细胞和ST细胞等支撑技术平台[4]，可直接应用于疫苗新工艺的开发。有理由相信：未来几年，我国的反应器细胞培养技术在生物制药行业的应用范围、反应器细胞培养技术的发展和成熟都将达到新的高度，这对提高我国疫苗生产技术水平、疫苗质量，促进我国从疫苗生产大国逐步升级为疫苗生产强国都具有十分重要的意义。

参考文献

1、   Radlett A.J.,Telling R.C, Applied microbiology, 1971, V22(4):534-537

2、   Heath C. and Kiss R., Cell Culture Process Development: Advances in Process Engineering，2007，Biotechnol. Prog. 2007, 23, 46-51

3、   张嗣良，张恂等，发展我国大规模细胞培养生物反应器装备制造业，中国生物工程杂志，2005，25(7)：1～8

4、   张韧，王建超，朱希灿等，顺应疫苗行业技术创新潮流，变供应商为支撑技术提供者，中国医药生物技术， 2008，3（4）：246－249

5、   Wurm F., Cell and tissue culture media usage trends. Genetic Engineering News, 2005

6、   Hellman A., Regan J.D., Large-Scale Cultivation of Mammalian Cells in Vitro, Applied microbiology, 1967, V15(1): 201-202

7、   Wei-Shou Hu and Aunins J.G., Large-scale mammalian cell culture, Current Opinion in Biotechnology, 1997, 8:148-l 53

8、   Trummer E., Fauland K., Process Parameter Shifting: Effect of DOT, pH, and Temperature on the Performance of Epo-Fc Expressing CHO Cells Cultivated in Controlled Batch Bioreactors, Biotechnology and Bioengineering, 2006,V94(6):1034-1044

9、   林福玉，陈昭烈等，哺乳动物细胞培养生产药用蛋白的关键环节，生物技术通讯，2002，v13(1):62-65

10、Pay, T.W, Radlett P. J., The use of BHK suspension cells for the commercial production of foot and mouth disease vaccines over a twenty year period, Develop. Biol. Standard, 1985,60, 163-170