氯化铯密度梯度离心纯化轮状病毒

病毒云

［摘要］ 纯化是研究病毒理化特性、生物学和免疫学特性的重要步骤和要求。在纯化病毒的方法中，氯化铯（CsCl）密度梯度离心法是较为常用的方法之一，方法简便易行，获得的病毒样品较纯。本文报道一种轮状病毒(RV)的CsCl密度梯度离心纯化方法，在离心前用聚乙二醇（PEG 6000）浓缩得到的病毒增殖液中加入56％CsCl，使其成为均匀混合液，经水平转头密度梯度离心后，可以将病毒分成3条乳白色区带。在密度梯度离心前，病毒样品是否用三氟三氯乙烷抽提，结果也有差别。经SDS-PAGE、Western、病毒的感染性滴度测定结果表明，所纯化的病毒具有较高的纯度和很好的回收率。

［关键词］ 氯化铯；密度梯度离心纯化；轮状病毒；三氟三氯乙烷


A组轮状病毒（rotavirus RV）是婴幼儿病毒性腹泻的主要病原体，全世界每年5岁以下死亡的儿童中，因RV感染而腹泻致死的约有60万人［1］。另外，许多动物和禽类也感染RV［2］。所以RV不但威胁到人类的健康，也严重影响了畜牧业的发展。

    RV是具有三层同心圆结构的二十面体，基因组由分为节段的11条双链RNA片段组成，分别编码6个结构蛋白（Vp1、Vp2、Vp3、Vp4、Vp6、Vp7）和5个非结构蛋白（NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5）［3］。其中，Vp6约占病毒蛋白的51％，是RV的主要抗原蛋白［4］。

    电子显微镜下，感染宿主的RV可见3种类型的病毒颗粒。完整的病毒颗粒为球形，直径75 nm,无包膜［5］。普通电镜下，病毒的核衣壳呈双层。外层光滑，内层的壳粒排列成放射状。低温电镜下，该种颗粒的核衣壳实际上有三层，含有结构蛋白Vp1～Vp7,具有感染性。除完整颗粒外，粪便中还可见单、双层颗粒，其颗粒的表面粗糙，不含Vp4和Vp7,不具有感染性［6］。本研究用CsCl梯度离心的方法成功获得了三层病毒、双层、单层病毒的颗粒，并分析了三氟三氯乙烷对氯化铯密度梯度离心纯化轮状病毒所造成的影响，为进一步研究RV的结构和功能提供了技术平台。

    1 材料与方法

    1.1 材料 （1）MA 104细胞：非洲绿猴肾细胞。本所中心实验室保存。（2）病毒：A组人RV Wa株，本所中心实验室保存。（3）MEM培养基（日本制药株式会社）。（4）CsCl (Gibco)、三氟三氯乙烷（Sigma）。

1.2 方法


    1.2.1 培养细胞 MA 104细胞在含有10%小牛血清的MEM培养基的100 ml方瓶中培养。当细胞长至单层时，用PBS洗细胞3次，留待病毒感染用。

    1.2.2 病毒的增殖 Wa病毒液用10 μg/ml乙酶在37 ℃水浴中孵育1 h，加入用PBS洗过3次的MA 104单层细胞中，每瓶加0.5 ml。37 ℃吸附1 h后，加入不含小牛血清的 MEM维持液，放37 ℃恒温培养箱培养至90％左右细胞出现CPE时收获，-20 ℃冻融3次，4 ℃ 5000 rpm，30 min离 心，收集上清液（病毒液）。

    1.2.3 病毒浓缩 （1）PEG沉淀病毒：在收集到的病毒上清中加入5％的PEG 6000，4 ℃搅拌过夜（约18 h）。4 ℃ 10000 rpm离心1.5 h，弃上清。沉淀用TNMC缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5,100 mM NaCl,10 mM CaCl2，1mM MgCl2）悬浮，于4 ℃ 50000 rpm离心1 h，弃上清。沉淀用TNMC缓冲液重新悬浮，使其终体积为浓缩前的1%。（2）三氟三氯乙烷抽提：取一半PEG浓缩的病毒液，加入等体积的三氟三氯乙烷抽提1次，4 ℃ 12000 rpm离心10 min，收集水相。有机相再加入1/10体积的缓冲液抽提1次，同前离心，回收水相并合并。收集的水相用缓冲液10倍稀释，4 ℃ 50000 rpm离心1 h，弃上清，沉淀用TNMC缓冲液悬浮，使其终体积同抽提前。

    1.2.4 CsCl密度梯度离心 分别取相同体积的上述未经三氟三氯乙烷抽提和经三氟三氯乙烷抽提的Wa病毒液，与CsCl制成56％的匀浆液，装入5 ml梯度离心管中，水平转头4 ℃ 50000 rpm，离心22 h。收集离心后形成的各区带，用TNMC缓冲液稀释10或15倍，4 ℃ 50000 rpm离心1.5 h，以去除残余CsCl。

    1.2.5 SDS-PAGE检测纯化病毒蛋白 用梯度胶（8%～12%～15%分离胶，5％浓缩胶）检测纯化的病毒。取10 μl病毒液，加2.5 ml 5×变性缓冲液,100 ℃加热变性5 min，140 V恒压电泳，待溴酚蓝迁移到凝胶底部时，停止电泳。凝胶用考马斯亮蓝染色。

    1.2.6 Western blot检测 纯化病毒样品如1.2.5进行SDS-PAGE分离，待溴酚蓝迁移到凝胶底部时，取下凝胶，在恒流250 mA电泳1 h，将凝胶上的病毒蛋白转印到硝酸纤维膜上。硝酸纤维膜经封闭过夜，洗涤后，加入豚鼠抗RV Vp6免疫血清抗体［7］，室温作用2 h，洗膜4次。加二抗（羊抗豚鼠标记辣根过氧化酶），室温作用2 h，洗膜4次，加底物（DAB）显色。

    1.2.7 病毒的感染性滴度检测 病毒的感染性滴度检测用微量滴定法在96孔细胞培养板中进行［8］：取密度梯度离心收集到的各区带病毒样品，如前用乙酶（10 μg/ml），37 ℃
孵育1 h后，用维持液行连续10倍稀释，加入已长成单层的96孔MA 104细胞板中（加前细胞用PBS洗3次），每孔100 μl,（设正常细胞对照），放5％CO2孵箱37 ℃培养，48 h后判定结果。

    2 结果

    2.1 密度梯度离心 经CsCl密度梯度离心后，出现3条明显的区带，各区带界限清晰。可看出，经抽提过的病毒样品的第一条带位置比未抽提过的稍偏低些，且第一条带和第二条带距离较近，但未经抽提过的第一条带中絮状物较多。

     2.2 纯化病毒样品的感染性滴度测定 RV经抽提和未抽提的CsCl梯度离心后的CPE(TCID50/ml)的结果及比较，见表1。

    2.3 纯化病毒样品蛋白的检测 经SDS-PAGE分离后，未经抽提过的纯化病毒样品的蛋白含量要比抽提过的高些，见图2，这可能是三氟三氯乙烷抽提过程中对病毒蛋白的损害造成的。

    2.4 纯化病毒样品Western blot检测 见图略3。表1 CsCl密度梯度离心纯化的病毒样品感染性滴度 图2 纯化病毒样品SDS-PAGE检测（略）

3 讨论


    病毒纯化是病毒研究中的主要步骤难点，密度梯度离心是病毒纯化中比较常用的方法，常常被许多实验室采用［9］。蔗糖因对病毒损伤较小，基本不破坏病毒的外壳蛋白，在病毒纯化中显示了一定的优越性［10，11］，但在蔗糖密度梯度离心中，其形成的带常常比较松散，这样，要想把病毒和细胞培养物分离开就比较困难,氯化铯密度梯度形成条带比较紧密，这样就可以得到比较纯的病毒。该方法重复性好，具备超离设备的实验室可以用来纯化足量的病毒［12］。

    对上样前的RV样品用三氟三氯乙烷抽提，可以去除许多细胞培养物，给病毒纯化带来方便。我们比较了用三氟三氯乙烷抽提和不用三氟三氯乙烷抽提，结果显示，用三氟三氯乙烷抽提能去除许多杂质（见图2），但也造成了病毒的损伤（见图1），因为抽提过的样品所形成的条带比不抽提过的条带位置更低（轮状病毒外壳蛋白被损伤，其密度将变大，故条带下移）。微量滴定［11］结果也显示，抽提过的样品其感染性滴度也有所降低（带1和带3约降低7%～8％，带2约降低18％）。另外，抗轮状病毒Vp6的特异性抗体的Western blot的结果说明，纯化的RV保存了完整的外壳蛋白Vp6。

    以上结果表明，CsCl密度梯度离心法是一种从感染细胞培养上清中分离纯化轮状病毒较好的方法，此方法纯化得到的样品为进一步研究RV的结构和功能打下了很好的基础。

    ［参考文献］

    1 Parashar UD,Humelman EG,Bresee JS,et al.Global illness and deaths caused by rotavirus disease in children.Emerg Infect Dis,2003,9:565-72.

    2 Saif LJ,Rosen BI,Parwani AV,Animal rotavirus.In:A.Z.Kapikian (Ed).Viral infections of the gastrointestinal tract.Marcel Dekker.NewYork,1994,279-367.

    3 Estes K,Ohen J.Rotavirus gene structure and function.Microbiol Rev,1989,53:410-449.

    4 Mathieu M,Petitpas I,Navaza J,et al.Atomic structure of the major capsid protein of rotavirus:implications for the architecture of the virion.EMBO J,2001,20(7):1485-1497.

    5 Yeager M,Dryden KA,Olson NH,et al.Three-dimensional structure of rhesus rotavirus by cryoelectron microscopy and image reconstruction.J Cell Biol,1990,110:2133-2142.

    6 黄文林.分子病毒学.北京：人民卫生出版社，2002,321-325.

    7 曹志亮，文喻玲，陈元鼎.A组人轮状病毒VP6基因克隆及在大肠杆菌中的表达.中国生物工程杂志,2006,26（3）：37-42.

    8 刘晓，李嘉琦，陈元鼎.重组轮状病毒抗原表位亚单位疫苗的小鼠保护性.中国医学科学院学报,2005,27(2):309-315.

    9 黄克和，李培英.应用间接ELISA检测动物隐孢子虫病原体.中国兽医学报,1999，19：353-355.

    10 曹康，张卫东，李明远,等.2种纯化流感病毒方法的比较研究.河北医科大学学报,2005，26：179-181.

    11 黄祯祥.医学病毒学基础和实验技术.北京:科学出版社，1990，452-462.

    12 徐洪涛，朴春爱，侯云德,等.中国对虾非包涵体型杆状病毒核衣壳的分离纯化.病毒学报，2000，16：182-184.

    作者单位： 650118 云南昆明，中国医学科学院 中国协和医科大学医学生物学研究所（△通讯作者）

    作者简介：陈元鼎，男，1959年5月生；1982年1月毕业于云南大学生物系，理学士。1995年4月毕业于联合国工业发展组织国际遗传工程和生物技术中心（意大利），分子病理学博士后。现为中国医学科学院中国协和医科大学医学生物学研究所研究员。

    主要从事分子生物学、分子病毒学，病毒免疫学和病毒疫苗的研究工作。至今主持完成过10余项省部级科研项目和国际合作项目，在国内外学术杂志上发表过70余篇学术论文，获得过8项省部级科技成果奖。

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蔗糖、甘油和氯化铯密度离心分离的区别
CsCl可自行形成密度梯度，所以不必特别制备密度梯度，只要将待分离的样品与之混匀即可。在离心的过程中，具有不同密度的颗粒随CsCl密度梯度的形成重新分配;而蔗糖和甘油要人工置备密度梯度。蔗糖和甘油的最大密度为1.3g/cm3 ，所以只能用于分离密度在 1.3g/cm3以下的细胞器或细胞结构;而氯化铯的最大密度可达1.9g/cm3以上， 可用于分离密度大于1.3g/cm3的DNA分子。在原理上，由于具有不同密度的颗粒随CsCl密度梯度的形成重新分配，所以又称为浮力密度离心(buoyant density centrifugation); 而蔗糖和甘油则是在被离心的物质在下降的过程中由于密度的不同而被阻止在不同的部位，故是重力密度离心。