cell report：MDA-5抗病毒免疫调节新机制

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天然免疫应答对于抵抗病毒的感染十分重要。RIG-I与MDA-5是最常见的细胞内部识别病毒RNA的信号分子，它们的识别与激活能够传递胞内的抗病毒免疫反应。MDA-5能够识别较长的双链RNA分子，而RIG-I识别的序列长度较短。

对于MDA-5来讲，它由N端的两个CARD结构域，中部的RNA解旋酶结构域以及C端的一个结构域（CTD）构成，其中CTD负责识别胞内的双链病毒RNA分子。随后，MDA-5围绕RNA分子通过蛋白-蛋白相互作用彼此头尾相连，最终形成纤维状的结构。这一结构能够促进CARD的寡聚化，而寡聚化后的CARD复合体则能够进一步结合位于线粒体上的MAVS蛋白进行信号的传递。以前的研究显示MDA5的活性受到其CARD的磷酸化调控，然而内在的分子机制却仍不清楚，同时C端的功能也同样不清楚。

最近，来自北海道大学的Tsukasa Seya课题组在《cell report》杂志上发表了他们对MDA-5 C端磷酸化的分子机制以及其作用的相关研究。


首先，作者通过体外的生化实验证明MDA-5存在磷酸化形式。他们发现在HEK293细胞中过表达的FLAG-MDA-5在SDS-PAGE中移动速度较慢，而在加入磷酸酶CLAP后该蛋白的迁移速度明显加快。之后的突变分析证明该磷酸化存在于MDA-5的C-端。

为了找到作用于MDA-5的蛋白激酶，作者进行了酵母双杂交实验。实验结果显示：RIOK3与MDA-5 C-端存在相互作用，后续的免疫共沉淀实验证明了这一结论。另外，作者还通过共聚焦显微成像的手段证明了MDA-5与RIOK3存在共定位，而且它们不论在刺激前后均位于胞浆中，而远离线粒体。之后，作者通过RNAi的手段人为降低了RIOK3的水平，结果MDA-5的磷酸化程度明显上升。这一结果说明RIOK3参与了MDA-5的磷酸化。

接下来，作者希望了解RIOK3对MDA-5的磷酸化对于这一信号究竟有什么影响。通过在HEK293中过表达MDA-5与RIOK3，作者发现RIOK3的存在能够明显抑制MDA-5过表达带来的免疫信号增强，然而，MAVS过表达产生的免疫信号并不能被RIOK3所抑制，这说明RIOK3的作用产生在MAVS的上游。另外，作者通过RNAi人为下调HEK293细胞中RIOK3的表达量以及使用RIOK3敲除的HEK293细胞进行实验也得到了相同的结论。

之后，作者利用突变分析的手段证明了RIOK3特异性磷酸化MDA-5在828位的丝氨酸。另外，作者还通过生化实验证明了RIOK3对MDA-5的磷酸化抑制了其在激活条件下形成多聚体的活性。

综上，通过一系列生化试验，作者证明了一个新的抗病毒免疫调控机制。

（生物谷Bioon.com）

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RIOK3-Mediated Phosphorylation of MDA5 Interferes with Its Assembly and Attenuates the Innate Immune Response

Ken Takashima, Hiroyuki Oshiumi, Hiromi Takaki, Misako Matsumoto, and Tsukasa Seya


Highlights
•RIOK3 attenuates MDA5-mediated innate immune response
•RIOK3 mediates phosphorylation of MDA5 Ser-828
•Phosphorylation of MDA5 Ser-828 disrupts its assembly and signaling
Summary
MDA5 is a cytoplasmic viral double-stranded RNA (dsRNA) sensor and triggers type I interferon (IFN) production. MDA5 assembles along viral dsRNA, leading to the formation of an MDA5 filament required for activating the MAVS adaptor. A recent study has revealed that PP1α and PP1γ phosphatases are responsible for dephosphorylating MDA5 and are essential for its activation. Here, we identified RIO kinase 3 (RIOK3) as a protein kinase that phosphorylates the MDA5 C-terminal region. RIOK3 knockout strongly enhanced type I IFN and IFN-inducible gene expression following measles virus infection. Conversely, the ectopic expression of RIOK3 or a phosphomimetic MDA5-S828D mutation attenuated MDA5-mediated signaling. Moreover, RIOK3-mediated MDA5 phosphorylation impaired MDA5 multimer formation, indicating that MDA5 C-terminal phosphorylation interferes with MDA5 filament formation and suppresses its signaling. Our data revealed a regulatory mechanism underlying the activation of the cytoplasmic viral RNA sensor MDA5 in both uninfected and virus-infected cells.

http://www.cell.com/cell-reports/abstract/S2211-1247(15)00296-X