|
|
导语：与DNA凝胶电泳一样，蛋白质凝胶电泳也是实验室中稀松平常的工作。无论是Western blot还是质谱分析，都离不开蛋白电泳。研究人员通过大小（1D）和电荷（2D）来分辨蛋白质。当然，仅仅分离蛋白是不够的，它们必须要经过染色。染料的选择有很多，具体选哪种，这取决于灵敏度要求、现有的设备和下游的应用。
' K3 ^/ Q# h1 R) \& |+ [9 E7 ]) J w. Q- u
常规之选4 m0 n1 b3 a8 Y5 K
+ y! m% _8 l$ f) \0 H# h$ h$ p5 I7 o研究人员主要使用三种染料来处理日常的蛋白凝胶：考马斯蓝、银染和荧光。据Sigma-Aldrich公司蛋白技术的高级研发经理Jeffrey Turner介绍，染料的选择基本上可以归结为“灵敏度 vs. 速度”。
3 y- L, m- a+ Y9 B! |! P* p4 [考马斯蓝也许是最常用的染料。作为一种可见的显色（亮蓝色）染料，它不需要任何特殊的设备。不过，Bio-Rad的业务开发经理Ning Liu认为，它的灵敏度也最低，检测极限大约在10-100 ng蛋白质。7 C9 {% @( [: Z9 o
- M9 j) Q, w6 A1 X( s
很多公司提供不同配方的考马斯蓝染料，它们在使用简便程度、整体染色时间和脱色要求上各有不同。例如，有些需要在乙醇/乙酸中固定，而有些只使用纯水。Expedeon的InstantBlue™试剂可在电泳后直接添加到凝胶中，而不需要固定或脱色，染色可在15分钟内完成。Bio-Rad的QC Colloidal Coomassie Stain操作则建议慢慢来，以便达到更好的效果。整个过程包括在40%乙醇/10%乙酸中固定15分钟，之后染色1-20个小时，再脱色1-3小时。
, E# p0 b! I- [- R有了赛默飞世尔最新推出的Pierce™ Power Stainer，研究人员可以让考马斯蓝染色自动化。据它的产品经理Emily Goplen介绍，这台设备可对两块凝胶进行染色和脱色。“尽管传统的染色需要几小时甚至过夜，Power Stainer却能在10分钟内完成染色和脱色的过程，并且预制胶和自制胶都适用，”她说。
$ v5 V3 T9 X" V3 _. C9 _) r: h' ^
另一种常用方法是银染，每条带的灵敏度大约在0.1-0.25 ng。操作过程没有脱色步骤，但是一个很长的过程，大约在2小时左右，而且相当讲究。此外，据Turner介绍，操作需要用到一些有害的化学物质，如甲醛和银，最好在通风橱中进行。因此，人们一般不大愿意用这种方法，除非灵敏度很重要。0 O! y, H! x/ t3 R* y4 U4 n8 U6 O) u
( L% l/ C( p! V+ |) ~荧光染料的灵敏度则居中，可检测几纳克的蛋白质，不过你得有一个兼容的凝胶成像系统或透射仪。与考马斯蓝和银染一样，荧光染色通常在电泳后进行，需要固定和脱色，不过也有例外。例如，SYPRO Ruby需要脱色，但Oriole和Flamingo不需要，因为游离的染料不发荧光。“染料本身不会被激光激发，只有当它与蛋白结合时才被激发，”Liu解释道。5 V+ S3 ^8 I9 u% A: d" i% d
0 ]/ A g' j1 _, ?. V! U
除了这些常规的染料，你还有一些特殊的选择。例如，赛默飞世尔为糖基化和磷酸化的蛋白提供了Pro-Q荧光染料，同时也提供InVision™ His-tag In-gel Stain和Lumio™ Green Detection Kit来检测带标签的蛋白。/ @$ w# e! }! ]
( g. [+ G* @ N3 {5 Q
0 O$ N# D, G8 B0 e6 k/ Y+ c
2 n8 N! F8 o4 k6 i升级之选' e7 E2 j. W2 v# A' I/ A. I
$ O4 \( J! j5 y! x( e v有些染料则让你省去了电泳后的洗涤和染色。比如，Bio-Rad的Stain-Free™预制胶预加了一种与色氨酸结合的“三卤”荧光染料。电泳后，凝胶暴露在紫外线下会激活染料，使其与蛋白质共价结合。据介绍，这种染料的灵敏度与考马斯蓝差不多。* G( o: G) g9 \; t5 W+ P
/ m o- A4 @% o0 l0 G/ z
另一个选择是GE Healthcare的Amersham™ WB系统。有了这个系统，样品在电泳之前与Cy 5荧光基团偶联。据GE Healthcare的资深科学家Åsa Hagner McWhirter介绍，在电泳过程中，游离的染料会跑出凝胶，因此没必要脱色，而且灵敏度在50-100 pg的范围。更方便的是，这个系统在电泳结束后自动对凝胶成像并分析结果。3 z1 A8 U! Q" W+ e. t
. _, f, T+ o; e0 gLiu和McWhirter都指出，电泳前染色的方法有一个明显的优点，就是染料与分离后的蛋白共价结合。因此，在后续的步骤中能够观察这些蛋白，特别是在Western blot中，可利用总蛋白的信号来标准化目标蛋白的信号，而不像平常那样用看家蛋白。9 c$ M2 K! ~& H: y3 Y# b
! p' Z3 P l* }! |- v
“这种方法明显消除了人们对看家蛋白对照的两个担心，”Liu表示。第一，在不同的实验条件下，看家蛋白的水平有时候会变化。其次，它们的水平可能超出了检测的线性动态范围，使得定量变得复杂。《The Journal of Biological Chemistry》杂志也建议使用总蛋白水平来进行信号强度的标准化。6 E7 d/ K) k4 g
! F& c R. ^, L5 Y
McWhirter认为，预标记也明显提高了凝胶之间的重复性，因为洗涤和染色的步骤难以精确控制。“不同反应间的CV要比在不同溶液中孵育凝胶要低得多，”她指出。事实上，她声称在内部分析14个样品时，Cy5信号的CV大约在5%。“这基本上和移液误差差不多。”* C% W( C3 ?. `
8 m9 ^ L* F* N5 j6 u8 {( e关键考虑0 ?" e! p7 |# P' n
. c& B' z- U* g9 l$ K! J8 }0 M
无论你选择哪种染料，在考虑灵敏度、速度和硬件要求外，你还要考虑下游怎么处理凝胶。若是印迹杂交，研究人员通常不用考马斯蓝染色，因为染料需要固定的步骤，会将蛋白困在凝胶里。他们要么平行跑一块相同的胶，要么在转印之后对印迹膜染色。同样，与蛋白共价结合的染料有可能干扰抗体结合或质谱分析。
, U: q- O0 C0 _7 R4 r8 P* _ h1 q8 d! g
当然，并没有一个放之四海而皆准的解决方案。考马斯蓝是大多数研究人员的首选染色，但在特殊情况出现时，我们还是有很多其他的选择。
" P+ w3 ?8 k! n0 f# \% O; a" ?2 b* c6 ]; F5 q. M. H& p/ }
9 D; P6 X% k; n. I5 N本文来源：生物通: w* `7 e* I" O( s
http://www.ebiotrade.com/
# Q8 W( [0 h5 R* i |
|
发表于 2015-10-26 12:32:19
QQ好友和群
QQ空间
腾讯微博
腾讯朋友
收藏
分享
支持
反对
发表于 2016-1-15 23:41:14
