[转移帖]荧光免疫染色和DAPI染色实验

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本帖由jbclinnic 于 2009-5-20 11:36 发表于原论坛




实验原理
免疫染色的实验原理类似于Western Blotting，两者都是运用抗体的特异性识别作用来显示目的蛋白，但是由于免疫染色需要在原位进行，而且蛋白没有经过富集，因此其实验难度较高。
实验的基本原理是：利用固定剂（通常是甲醛或多聚甲醛）将细胞固定，使得细胞膜的通透性大大增加，并且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋白变性，从而使通透性进一步加强。利用正常羊血清封闭，可以令许多蛋白先与血清内的非特异性抗体结合，而特异性的抗体由于动力学的关系可以通过竞争性的反应与目的蛋白结合，这一过程可以保证抗体识别的特异性。
二抗可以特异性识别一抗的Fc区域，利用二抗连接不同的荧光基团，就可以在荧光显微镜下观察到不同的荧光，从而显示目的基因的表达情况。
另外，免疫荧光实验由于其较高的敏感性可以显示出基因表达的亚细胞情况(核内，核外，膜上以及一些较大的细胞器上)，所以通常被用来作为基因定位的方法。

DAPI的中文名称是4，6-联脒-2-苯基吲哚，是一种常用的荧光染料，其作用机理与溴化乙锭（EB）等染色剂的机理类似：它们与DNA双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用，从而与DNA的双链紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好UV（紫外光）的激发波长是356nm，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。
Jagielski M. et. Al在1976年首次运用该技术检测细胞培养中的支原体感染。后来随着技术的进步，该技术被运用于各种微生物的检测、生长监测，胚胎发育过程的检测，细胞周期的检测和各种核定位的实验。
本实验就是利用DAPI染色标记细胞核的位置。


实验用具及材料
1) 试剂
MyoD抗体（一抗）
TRITC（罗丹明(红色)）或FITC（异硫氰酸（绿色））连接的抗体（二抗）
NGS（正常羊血清）
PBS（磷酸盐缓冲溶液）
甲醛或多聚甲醛
Triton-X-100
Tween-20
DAPI染色液
2）设备与耗材
200ul/1ml微量移液器及Tip头
量筒
脱色摇床或涡旋振荡器
铝箔纸
荧光显微镜和CCD
冰箱/37摄氏度培养箱

4. 实验步骤
1) 在染色前的细胞密度约是0.8X105/孔（293T细胞/六孔板每孔）。
2) 移去完全培养基，用PBS清洗一次。
3) 用10％的甲醛溶液或者4%的多聚甲醛PBS在室温固定20分钟。
4）用PBS在室温漂洗三次，每次10分钟。
5）用含0.5%Triton-X-100的PBS在室温通透化处理15分钟。
6）用PBS在室温漂洗三次，每次10分钟。
7）在室温用含10%NGS的PBS封闭1小时，或者在4摄氏度封闭过夜。
8）在37摄氏度用特异性一抗孵育半小时，或者在室温下孵育一小时以上或者4摄氏度孵育过夜。
9）用含0.1% Tween-20的PBS在室温漂洗三次，每次10分钟。
10）用铝箔包裹后在37摄氏度用二抗孵育半小时以上，或者在室温下孵育一小时以上。
11）去除二抗，加入DAPI染色液室温作用15分钟以上。
12）用含0.1% Tween-20的PBS在室温漂洗三次，每次10分钟。
13）在荧光显微镜下观察，用合适波段激发，照相保存实验结果。