实验 植物病毒和病毒病害

jbclinnic

1．目的要求 病毒是一种非细胞形态的，在寄主细胞内营专性寄生的一种生物体。病毒粒体很小，在一般光学显微镜下看不到它，不易根据形态特征作出鉴定。因此病毒的研究方法与真菌、细菌也就有所不同。植物病毒的鉴定，除去可以利用电子显微镜观察它的形态以及根据它在植物上引起的症状，传染方法，体外抗性和血清学反应以外，还要用近代生物物理和生物化学方法研究它的物理和化学性状。
　　实验要求通过病毒病症状的观察、病毒粒体和病组织中内含体形态的观察，掌握病毒病的发生特点和诊断技术，为进一步认识和控制病毒病害奠定基础。
　　2．材料和用具
　　实验材料：烟草花叶病毒病(TMV)、黄瓜花叶病毒病(CMV)、蚕豆萎蔫病毒病(BBWV)、小麦土传花叶病(SbWMV、WSpMV)，大麦黄矮病(BYDV)、大豆花：叶病(SMV)，芜菁花叶病(TuMV)，马钤薯卷叶病(PLRV)，烟草环斑病(TRSV)等。
　　仪器及用具，光学显微镜，透射式电子显微镜(TEM)，载玻片，盖玻片，电镜制片用铜网，磷钨酸负染液(2％PTA，pH6.0)，微量喷笔、真空喷镀仪。
　　内含体染液：(1)碘液(即细菌作革兰氏染色用的鲁戈氏碘液)，(2)锥虫蓝液(锥虫蓝0．5g溶于100ml加热的0．9M NaOH中成为原液，使用时稀释2 000—5 000倍)；(3)焰红液(1％焰红水溶液)。 小镊子，刀片，剪刀，显微镜，载玻片，盖玻片，纱布、滴瓶等。
　　3．内容与方法
　　3．1 病毒病症状 大体分三种类型，视寄主种类及病毒特性而各异，还与环境条件密切相关。
　　3.1.1 褪色或变色 这是最常见的症状。植物叶片部分褪绿而形成斑块状不均匀变色边缘清晰的称为“花叶”，边缘不清晰的称斑驳，全面褪色的称为“黄化”。花叶是植物感染病毒后最常见的症状，因此很多病毒病都称为“花叶病”。
　　(1)花叶：观察大豆，白菜花叶病或瓜类花叶病。注意叶片颜色的变化，厚薄均匀否?有无皱缩?植株的那些叶片表现的症状最明显?典型花叶症状最先表现为叶脉透明(脉明)，有的叶脉转黄(黄脉)，最后才表现叶色的深浅不一，黄绿相嵌。叶面皱缩不平的花叶症状，观察花叶型症状的发展过程。
　　(2)黄化：观察马铃薯卷叶病(或小麦，豆类黄化型病毒病)的症状，注意病株变黄，叶片上卷，较健叶稍厚等特点。
　　3．1．2 组织坏死 受病植物组织局部枯死，枯死发生于叶片的称为枯斑，发生于茎干和果实上的称为条纹或条斑。
　　观察油莱病毒病枯斑型症状，番茄条纹病毒病，烟草坏死病毒病的标本，注意不同的受害部位和枯死症状。
　　3．1．3 畸形 全株或部分器官表现各补畸形，观察水稻萎缩病、番茄蕨叶病的标本，哪些部位组织的形态与健全的植株不同?注意区分矮化与矮缩，斑驳与花叶的症状。
　　一种病毒在不同的寄主植物上表现的症状不同，这也是鉴定病毒的重要性状。观察烟草花叶病毒在普通烟草(Nzcotiona tabacum)和心叶烟(N．glutinosa)上的症状，有什么不同。
　　3．1．4 病毒病症状的变化 植物病毒病的症状常因环境条件的影响而有很大的变化，也可因不同病毒的干扰而发生改变，有时还因寄主品种抗性的不同而有变化。正确识别一种病毒在不同条件下的症状变化对诊断有重要价值。
　　(1)隐症现象：苜蓿花叶病毒(AMV)或蠕传多角体病毒在幼嫩植株上的症状明、显而典型，随着植株老化，症状逐渐隐退。病毒症状也可因温度而变化。大豆花叶病毒病在25℃以下时表现典型的花叶症状，当气温超过30℃时，症状减轻，进而消失，外观正常，当气温降低后，症状又重新表现出来。观察在不同气温条件下生长的病株症状，有无差异?
　　(2)综合症：病毒侵害植株后，寄主可同时或相继产生不同类型的症状，称为病害的综合症。大豆苗受烟草环斑病毒危害后可相继表现花叶、皱缩，幼芽坏死等症状。
　　(3)交叉保护：寄主遭受一个弱毒或无毒株系的病毒侵染后，体内产生一定抗性，从而可免受或减轻另一强毒株的侵染危害，在黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒中均有许多实例。
　　(4)协生作用：当两种病毒同时侵染一个寄主时，相互间没有干扰影响，反而互相有累加作用，从而使寄主表现比单独侵染时更为严重的症状。大豆花叶病毒和菜豆荚斑病毒同时侵染大豆时，常使大豆表现顶梢坏死和严重的矮化，而不仅是花叶症状。
　　3．2 病毒病的内含体 一些植物遭受病毒侵害后，组织内部有一些结晶体或不定形的非晶状体出现，有的是病毒颗粒本身聚集而成，更多的是受病毒刺激后在组织中形成的一些细胞成分与病毒蛋白质共同组成的。晶状体常成柱状，块状或层状排列，有些不定形的称为X体，马铃薯Y病毒组的病毒侵染后常产生风轮状内含体。内含体有大型的，可在光学显微镜下观察，有的很小，要在电子显微镜下才能看清。内含体也可作为诊断病毒病种类或病毒鉴定时的参考。
　　取烟草(蚕豆或大豆)花叶病的病叶，用刀片在叶背的叶脉上切一小口，用镊子轻轻撕下一小块表皮，平置于载玻片上的水或碘液滴中，加上盖玻片，放在显微镜下检查，在表皮毛的基部细胞中可见到病毒的晶状内含体，多数为六角形。如蚕豆花叶病毒，经碘液染色后可见到无定形的X体，呈黄褐色，细胞核为鲜黄色。如用锥虫蓝液染色，则细胞核在30秒钟内染成蓝色， 内含体染成深浅不均的颗粒体，易于区别。用焰红染色液不用水洗，直接镜检，细胞核粉红色，内含体鲜红色。
　　同样的方法，用健叶作对照，看有无这些内含体。
　　绘图，表示出烟草衰皮毛附近TMV的内含体形态。
　　3．3 病毒的粒体形态 植物病毒的粒体概分圆球状弹状与杆状三大类。
　　病毒粒体形态的观察要在透射式电子显微镜下进行。将病毒样本涂布在特制的被有Formvar薄膜的铜网上，经喷金和喷碳处理，再用磷钨酸负染液(2％PTA)处理后放入电镜中观察，可见到病毒的粒体。经过照相后，得到粒体的照片，根据放大倍数就可计算出粒体的长度与直径。
　　病毒粒体在电镜下的成像原理如图8所示。
　　在老师指导下，观看病毒样本的制片示范过程，并在电镜下观看病毒的粒体形态。
　　4．实验时间 2学时。
　　5．作业与思考题
　　(1)为什么叫负染色?
　　(2)如何计算电镜照片的放大倍数，怎样测量照片上病毒粒体的长度?计测示范照片上病毒粒体的大小。
　　(3)病毒究竟是生物还是非生物?证据是什么?