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发表于 2015-2-10 19:35:49
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附件4
RT-PCR法分型检测登革病毒核酸标准操作程序
1 目的
登革热患者和/或媒介伊蚊标本中病毒核酸的提取及PCR分型检测。
2 适用范围
适用于患者血标本及其传播媒介标本的检测。
3 检测的环境条件
在标本中提取登革病毒RNA的实验要求在BSL-2实验室操作,PCR分型检测在专门PCR室或区域操作。
4实验步骤
4.1实验准备
4.1.1在标本中提取登革病毒RNA要求在BSL-2实验室,PCR分型在综合实验室独立区域或专门PCR室操作。
4.1.2进入实验场所之前,要事先准备好所需试剂,样品。预约实验场所,并看前一位实验者是否已经清场。
4.2 RNA的提取
4.2.1 使用QIAampViral RNA Mini 试剂盒提取血清标本中病毒RNA
4.2.1.1 吸取560μl包含载体RNA的AVL 缓冲液至1.5ml的离心管中。
4.2.1.2 向上述的液体中加入140μl样品,脉冲涡旋式混匀15秒,室温孵育10分钟,简单离心使离心管顶端液体落到底部。
4.2.1.3 在样品中加入560μl 96-100%的乙醇,混匀15秒,再简单离心。
4.2.1.4 小心将630μl液体加入未浸湿的QIAamp小柱中,盖好盖,离心8000rpm/min 1min,弃去收集管,将柱子置于一新的2ml收集管上。
4.2.1.5 打开QIAamp小柱的盖子,重复步骤6,直至样品全部离心。
4.2.1.6 打开盖子,向柱中加入500μl AW1 缓冲液,盖好盖,离心8000rpm/min 1min,弃去收集管,将柱子置于一新的2ml收集管上。
4.2.1.7 打开盖子,加入500μlAW2 缓冲液,盖好盖,离心 14,000rpm/min 3min。
4.2.1.将柱子置于一新的2ml收集管上,空离1min。
h.将柱子置于一新的1.5ml离心管上,加入50μl AVE洗脱缓冲液,室温孵育1min,离心8000rpm/min 1min。
4.2.2 RNeasy Mini Kit提取媒介组织标本或血液标本病毒RNA
4.2.2.1 从Kit中取出RLT液,根据标本数量分装适量RLT液按照1:100体积比分别加入β-巯基乙醇,分装至相应的预先标记好的微量离心管中,每管600µL。
4.2.2.2 将150 µl组织研磨混悬液分别加入相应的RLT液管中,充分混匀。
4.2.2.3 混匀后依次加入750µl 70%的乙醇,充分混匀。
4.2.2.4 从Kit中取出带收集管的滤柱,打开包装将其做好标记。取步骤2中的混合液750µl加入滤柱中,12000rpm,离心15s,弃收集管中的离心液。
4.2.2.5 滤柱仍放回收集管上,将步骤2剩余的混合液全部转入滤柱中,12000rpm,离心15s,弃离心液;
4.2.2.6 于滤柱中加入700µl Wash Buffer RW1液,12000rpm,离心15s。
4.2.2.7 从QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干净的2mL收集管,将离心后的滤柱移到新的收集管上,加入500µl Wash Buffer RPE液,12000rpm,离心15s。
4.2.2.8 弃收集管中的离心液,再于滤柱中加入500µl Wash Buffer RPE液,13000~14000rpm,离心2min。
4.2.2.9 将滤柱移到一个无RNA酶的干净的1.5mL eppendorf管上,向滤柱中加入30~50µl的RNase-free Water,室温静置1~3min。
4.2.2.10 12000rpm,离心1min,离心液即为病毒RNA,立即检测或-70℃以下保存。
4.3 常规半套式RT-PCR方法检测登革病毒核酸
4.3.1 引物:引物序列见下表
引物 序列 片段大小
D1 5’-TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG-3’ 511
D2 5’-TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC-3’ 511
TS1 5’-CGTCTCAGTGATCCGGGGG-3’ 482 (D1+TS1)
TS2 5’-CGCCACAAGGGCCATGAACAG-3’ 119 (D1+TS2)
TS3 5’-TAACATCATCATGAGACAGAGC-3’ 290 (D1+TS3)
TS4 5’-CTCTGTTGTCTTAAACAAGAGA-3’ 392 (D1+TS4)
4.3.2 PCR扩增
根据实验室内所使用病毒核酸PCR扩增试剂盒特点,正向引物 D1和反向引物D2配置第一轮PCR体系,进行第一轮PCR扩增。推荐反应条件为 94℃预变性2min,然后 94℃变性30秒,55℃退火30秒, 72℃延伸1分钟,反应40循环,最后72℃延伸10分钟。
第二轮分型PCR扩增体系配置采用正向引物D1与反向引物TS1、TS2、TS3和TS4。推荐反应条件为 94℃预变性2min,然后 94℃变性30秒,55℃退火30秒, 72℃延伸1分钟,反应30循环,最后72℃延伸10分钟。
4.3.3 1.5%浓度琼脂糖电泳分析,确定病毒型别。
4.3.4 结果判读
4.3.4.1 阳性:
1型:电泳显示略小于500 bp的DNA片段。
2型:电泳显示略大于100bp的DNA片段。
3型:电泳显示略小于300bp的DNA片段。
4型:电泳显示略小于400bp的DNA片段。
4.3.4.2 阴性:无特异性核酸片段扩增。
4.3.5 意义
阳性结果可以确诊登革病毒感染,可用于登革热早期诊断。
4.4实时定量RT-PCR法分型检测登革病毒核酸
4.4.1引物与探针
引物/探针 序列 荧光标记
DEN-1 8973F CAAAAGGAAGTCGTGCAATA
DEN-1 9084C CTGAGTGAATTCTCTCTACTGAACC
DEN-1 8998probe CATGTGGTTGGGAGCACGC FAM/BHQ-1
DEN-2 1443F CAGGTTATGGCACTGTCACGAT
DEN-2 1518C CCATCTGCAGCAACACCATCTC
DEN-2 1469probe CTCTCCGAGAACAGGCCTCGACTTCAA HEX/BHQ-1
DEN-3 740F GGACTGGACACACGCACTCA
DEN-3 813C CATGTCTCTACCTTCTCGACTTGTCT
DEN-3 762probe ACCTGGATGTCGGCTGAAGGAGCTTG TesasRed/BHQ-2
DEN-4 904F TTGTCCTAATGATGCTGGTCG
DEN-4 992C TCCACCTGAGACTCCTTCCA
DEN-4 960probe TTCCTACTCCTACGCATCGCATTCCG Cy5/BHQ-3
4.4.2 实时荧光定量RT-PCR扩增
实时荧光定量RT-PCR扩增反应配置体系,参考如下:
RNA模板5µl,酶0.5µl,缓冲液12.5µl,引物各0.5µl(共4对,8条),探针各0.25µl,加水至总体积25µl。
推荐反应条件为50℃30min,95℃2min,95℃15s、60℃30s反应40个循环。
4.4.3 结果判断
以荧光PCR反应的前3~15个循环的荧光信号作为本底信号,以本底信号标准差的10倍作为荧光阈值,标本扩增产生的荧光信号达到荧光阈值时所对应的循环数为循环阈值(Ct值),以Ct<35荧光信号数据线性化处理后对应循环数生成的曲线图成“S”形的标本,可判断为相应的登革病毒核酸检测阳性。
4.4.4 意义
是一种灵敏、特异、低污染的登革病毒RNA检测方法,可以定性或定量检测登革热患者血清或蚊媒标本中的登革病毒。
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