【转移帖】 G418筛选问题

cao1976

原帖由happy2392发表于 2010-4-20 11:54 ：

大家好，请问哪位有做过G418筛选单克隆的？望高手指点，谢谢！

cao1976

anzaishi发表于 2010-4-22 19:31 ：

1、用1M的HEPES配G418，一般可配成100,10或1mg/ml依个人需要——用HEPES的原因是缓冲能力比较好
2、先查找文献，知道所用细胞大概的筛选浓度A，然后进行筛选浓度的确定。
首先铺24孔板细胞，2孔重复。细胞密度要控制在50%-80%间，太密细胞撑不了两天，G418不杀，它都自己挂了，了，即使不挂G418也需要很高的浓度才能杀死细胞，这样浪费G418，所得到的筛选浓度不是很准确，但还是可以用就是；太稀细胞很容易被G418杀死。
其次是药物浓度问题。设置11个梯度，1个阴性。如果A=400mg/ml那你可以做20一个梯度差在400的前后各取5个值即（300，320，340，360，380，400，420，440，460，480，500）
最后是筛选周期。周期一般为1-2周不等，期间3天换一次液（浓度需保持一致），如果细胞死得很多或者培养基黄的厉害的话也可以1-2天换一次液。周期结束后会发现高浓度时细胞死亡，低浓度时细胞存活，中间有个临界值就是你要的筛选浓度
3、之后就可以用这个筛选浓度进行细胞的筛选工作了。
不知有没有什么遗漏或者错误的地方，还请指正。