重叠 PCR 目的条带模糊，求原因

randomqd

如下图，红色指向的为我所需要的条带，前4条还算可以，但是后面的6条结果比较差，个人觉得是后面的6条退火温度较低，体系是50ul的 然后退火温度为50度。片段大小4000左右，酶为takara的HS高保真酶！求各位大侠帮小弟找找原因

序道

我觉得你引物退火温度问题，后面几个你可以换换退火温度，还有我们一般扩长片段和扩短片段的反应稍微有些调整，比如可以添加其他试剂如二甲基亚砜、buffer等等

ipsvirus

你做overlap PCR的详细体系是什么？两个片段加了多少，引物加了多少？PCR循环条件什么？

基于你给出的结果，给我一个简单暴力的解决方法。虽然目的条带很弱，但还是回收，再以回收产物为模板，再次PCR即可。