丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)的分子病毒学

我容易吗我

摘要：世界范围的高感染率,治疗手段和疫苗的缺乏使HCV成为研究的热点。高效体外复制系统的缺乏，高突变率带来的株系间的不一致，为HCV的研究带来了困难。这个病毒的分离鉴定直接依赖于分子生物学手段。同样是使用分子生物学的手段，研究者对这个病毒的结构和各组分的功能进行了研究。本文从分子角度对这个病毒各组分的结构、功能和相互关系进行了综述，并讨论了HCV诱导疾病、免疫逃避的分子机理。 导言
    HCV是一个由脂膜包裹的正链RNA病毒。来源于宿主细胞膜的病毒包膜上整合有病毒编码的包膜蛋白E1和E2。被这层膜包裹的是结合有HCV核心蛋白的RNA基因组。这个看似简单的病毒如今已是人类健康的大敌。
    HCV是慢性肝炎的主要致病因子。在美国慢性肝病患者中，40～60％感染了HCV。(Williams，1999)。全世界约有一亿七千万人感染了HCV，这个数字高于感染了HIV的人口(Cohen，1999)。流行病学研究表明：约20%慢性肝炎患者要发展为肝纤维化和肝硬化，在这些肝硬化病人当中，20％要发展为肝癌(Seeff，1999)。对丙型肝炎病人的治疗目前还很不成功，在一家美国医院中，研究HCV病人用药结果显示：使用干扰素能清除部分病人体内的HCV，但产生效果的病人不到20％；组合使用干扰素和ribavirin效果稍好一点，但也只对少于40％的病人有效。所调查的样本为感染了不同基因型HCV病人的集合。如果注意到这些治疗方法对于最广泛分布的HCV基因型1效果很差，并且这些药物的昂贵和毒性也不容忽视（McHutchison et al，1998）， 我们不免感受到来自HCV的有力挑战。为了防止HCV的传播，人们在疫苗的研究上投入了很大精力。缺乏有效的体内、外HCV扩增系统，缺乏可信的保护性抗体分析系统以及HCV自身的高突变特性使得疫苗的开发困难重重。尽管目前市场上还没有一个HCV疫苗，蛋白免疫（Choo，et al.，1994），DNA免疫（Fournillier, et al, 1999; Gordon, et al., 2000），重组活疫苗免疫（Makimura, et al., 1996）以及这些疫苗的组合使用（Pancholi et al, 2000; Song et al, 2000）在实验动物中引起了一些鼓舞人心的体液免疫反应和细胞免疫反应。
    同样由于没有有效的HCV繁殖系统，从分子水平研究HCV很不容易。目前我们对HCV的认识绝大部分建立在重组技术的基础之上。
基因组：一个ORF和两个UTR
    组织培养，显微镜观察和繁复的血清学分析都没有能发现HCV。这个机警的病毒是被分子生物学手段所发现的 (Choo, et al., 1989)。研究者从大体积的高HCV滴度的猩猩血浆中抽提出核酸，制备cDNA并插入噬菌体基因组中。利用HCV病人血清对几百万个噬菌体克隆进行了筛选，只有一个阳性克隆被检测到。一年之后，这个非甲非乙肝炎病毒基因组的顺序被测定。此病毒则被命名为丙型肝炎病毒。由于相类似的基因组组织形式，HCV和黄病毒以及瘟病毒被归类至同一个病毒科－黄病毒科。正链单链的HCV RNA基因组长约9500nt。其5‘和3‘端都含有非翻译区（UTR），UTR之间是一个大的多蛋白开放阅读框架（ORF）。该ORF编码了一个长约3000氨基酸的多蛋白。研究表明这个多蛋白的切割加工由宿主编码的信号肽酶（结构蛋白）以及HCV编码的蛋白酶（非结构蛋白）共同完成。图1为HCV基因组结构示意图，宿主信号肽酶和病毒蛋白酶的对多蛋白的切割位点标注在示意图上。


图1.丙型肝炎病毒(HCV)基因组结构示意图
箭头所示为蛋白酶切割位点；

为宿主信号肽酶切割位点；
为NS3丝氨酸蛋白酶切割位点；
为NS2-3金属蛋白酶切割位点。  

    在HCV基因组的复制过程中，依赖RNA的RNA聚合酶随机地引入很多错误，结果HCV以非常异质（heterogenerous）的形态而出现，所有HCV株系间的同源性约为70％。HCV基因组的不同区段保守性不同，编码重要功能（聚合酶，核心蛋白，内部核糖体进入位点IRES，等）的区域高度保守，其他区域则含有较多的突变，尤其是膜蛋白的几个高变区。对于HCV的分型，目前被广泛接受的是分为6种基因型，它们之间的核酸差异可达30％。在基因型内部又分为很多的亚型。世界范围内最广泛流行的HCV是基因型1，尤其是1b，该亚型是亚洲，欧洲，北美和澳大利亚主要流行的基因型(Davis，1999)。从同一个病人的血液中分离到的HCV基因组也有很多差异，它们被称为不同的准种。
5'UTR：内部核糖体进入位点(IRES)
    5'UTR包含HCV基因组5'端的341个核苷酸。它是HCV基因组中最保守的部分。以单链和双链RNA特异的RNA酶做的酶学分析和计算机比较分析表明5'UTR含有典型的IRES二级结构(Brown, et al., 1992)。研究者因此推测HCV多蛋白的翻译是不依赖于5'帽子结构的，且不从第一个AUG起始，而是从内部的AUG起始。5'UTR的IRES功能为后来很多工作所证实（Tsukiyama-Kohara，et al., 1992; Wang, et al., 1993; Fukushi, et al., 1994; Rijnbrand, et al., 1995）。比如，Tsukiyama-Kohara，et al. （1992）在体外翻译系统中发现，含大部分5'UTR的mRNA从第四个AUG开始翻译，且5'帽子结构不影响其翻译效率；而当大部分5'UTR序列被缺失以后，5'帽子能大大提高HCV mRNA的翻译效率。几乎全长的5'UTR为核糖体内部起始所必需（Fukushi, et al., 1994; Rijnbrand, et al., 1995）。不改变读码框的插入、缺失和无义突变等实验表明，编码HCV核心蛋白N末端的序列也是IRES的组成部分（Honda, et al., 1996; Reynolds, et al., 1995, Zhao, et al., 1999），然而有人发现纯化的核糖体40S亚基能特异结合不含有HCV核心蛋白编码序列的HCV IRES（Pestova, et al., 1998），这样编码核心蛋白的序列可能只是有利于IRES二级结构的形成。
核心蛋白：重要的结构蛋白，且具有很多重要的非结构功能
    将HCV多蛋白的疏水性轮廓和黄病毒及瘟病毒进行比较，结合体外表达研究，人们将多蛋白N末端191个氨基酸定名为核心蛋白（Hijikata, et al., 1991a; Grakoui, et al., 1993a）。一般认为宿主信号肽酶将其从多蛋白上切割下来。核心蛋白的N末端富含碱性氨基酸且高度保守，这和它的重要功能是相一致的。核心蛋白的这一部分负责结合RNA，此功能被定位于氨基酸1-75（Santolini, et al., 1994）。和核心蛋白的功能相符合，HCV核心蛋白能够形成自聚体，使用类似的方法对该功能的定位得出不同的结果：酵母双杂交系统和缺失分析将此功能定位于aa36-91（Matsumoto, et al., 1996）；电泳、酵母双杂交系统、质谱和凝胶过滤色谱分析表明负责核心蛋白自结合的结构域位于蛋白羧端（Yan et al., 1998）。
    多年来的研究发现，HCV核心蛋白的成熟形式并非终止在以前认定的aa191。在两种体外哺乳动物表达系统，即痘苗病毒系统和CHO稳定表达株表达系统中均发现HCV核心蛋白的两种形式：一种终止在aa191(p23, 23kD)，另一种终止在aa174和aa191之间(p21, 21kD)。分析从HCV病人血清中分离得到的HCV核心蛋白，表明p21是天然病毒颗粒的组成部分（Yasui, et al., 1998）。
    核心蛋白同时定位于细胞质和细胞核。p23的C末端疏水区是包膜蛋白E1转位至ER的信号肽。去除此疏水区使核心蛋白进入细胞核成为可能。核定位信号位于核心蛋白的N末端（Chang, et al., 1994）。已发现HCV核心蛋白调控很多基因的转录，如p53等肿瘤相关基因（Ray, et al., 1995; Ray et al., 1997），一些细胞周期相关基因(Ray et al., 1998a)和细胞凋亡相关基因(Shrivastava et al., 1998; You, et al., 1999)。核心蛋白对转录的调控有直接和间接两种模式。定位于N末端的转录抑制因子结构域用于直接模式(Ray, et al., 1999)。HCV核心蛋白对I-κB降解的调控、对JNK (c-Jun N-terminal kinase)活性的调控则间接地抑制了很多重要基因的转录（Shrivastava et al., 1998; You, et al., 1999）。还发现核心蛋白和转录调节因子hnRNP K (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K)之间有蛋白-蛋白相互作用，结合hnRNP K的位点定位于aa25-91（Hsieh, et al., 1998）。
    核心蛋白对转录的调控可能与HCV致病机理有关（如肝癌）。通过对一些重要基因进行转录调控，HCV核心蛋白能抑制fas-和TNF-α介导的细胞凋亡（Ray, et al., 1998b; Marusawa, et al., 1999）。细胞凋亡是机体抗病毒感染的重要手段（Thompson, 1995; Nagava, 1997），阻断细胞凋亡可能有利于病毒在细胞中建立持久感染，因而可能是丙型肝炎慢性化的机制之一。已发现很多病毒蛋白能抑制细胞凋亡（Wang, et al., 1995; O'Brien, 1998; Shisler and Gooding, 1998）。有研究表明HCV核心蛋白能转化原代大鼠胚胎成纤维母细胞（Ray et al., 1996），表达HCV核心蛋白的小鼠细胞株BALB/3T3 A31-I-1的生长失去接触抑制（Tsuchihara, et al., 1999）。更在HCV核心蛋白基因转基因鼠中观察到肝癌的发生（Moriya, et al., 1998）。 核心蛋白的致癌能力使人们对它用于疫苗的研究产生怀疑，尽管核心蛋白含有很多体液免疫表位和CTL表位。有关核心蛋白的另一发现加强了这一怀疑：用多种结构的重组HCV-痘苗病毒感染小鼠发现，HCV核心蛋白具有免疫抑制作用（Large, et al., 1999）。
    此外，这个多功能的蛋白还被发现参与抑制宿主细胞中mRNA的翻译（Mamiya, et al., 1999）。
E1
    HCV多蛋白上氨基酸192到383编码HCV第一个包膜蛋白E1。信号序列aa174到191引导E1共翻译地转膜至内质网中（Hijikata, et al, 1991a）。基因工程表达的E1都定位于内质网膜上。和大部分定位于内质网膜的蛋白不同，此蛋白不含有KDEL或KKXX定位信号，其糖链也未经高尔基酶修饰，因而其滞留于内质网膜的机理与众不同，不是使用从顺式高尔基体拯救的机制，而是静态滞留于内质网。静态滞留信号位于E1的穿膜结构域aa311到383（Cocquerel, et al., 1999; Flint, et al., 1999）。E1是一个高度N-糖基化的蛋白，预测的N-糖基化图式位于aa196, 209, 234, 305和325，但突变分析表明第五个糖基化位点并不发生糖基化（Meunier, et al., 1999）。E1的穿膜结构域（TMD）具膜活化的特性，能改变E.coli的细胞膜透性，引起细胞的快速裂解（Ciccaglione, et al., 1998）。这可能是用E.coli表达E1的困难所在，缺失TMD后表达E1获得了成功（Yan, et al., 1994）。
    普遍认为在天然状态下E1和包膜蛋白2（E2）形成非共价的聚合物。E1的N末端负责和E2的N末端结合（Yi, et al., 1997）。又发现抗核心蛋白的抗体能将E1和核心蛋白共沉淀，利用缺失作图的方法发现它们相互作用的位置均在蛋白的C末端（Lo, et al., 1996），作者同时发现E2不能和核心蛋白共沉淀，可能核心蛋白和E2之间不存在直接的相互作用。
    E1的C末端同时还是包膜蛋白2（E2）的信号序列，引导E2转膜至内质网。
E2和p7
    E2有两种形式，两者起始于aa384，终止于aa746或aa809，后者被认为是在aa746/aa747位点加工不完全的产物（Lin, et al., 1994a; Mizushima, et al., 1994b）。p7就是 aa747-aa809，目前还没有发现其有何功能。两种形式的E2都是高度糖化的蛋白，糖链约占E2分子量的一半。HCV膜蛋白在真核表达系统中的高效表达加工需要共表达上游的核心蛋白和下游的非结构蛋白NS2（Matsuura, et al., 1994）。在Sf9昆虫细胞中表达E2羧末端缺失的结构C-E1-E2p(1-660)，结果得到很多分子量各异的，加工不完全的膜蛋白产物，它们反应了E1/E2和C/E1位点低效率的切割（Wang, et al., 1997）。人们观测到的基因工程表达的E2分子量相差很大，从58kD到75kD，原因包括：不同的表达系统翻译后加工不同，如酵母和哺乳动物的糖基化的差异；人们使用的不同的HCV基因型可能产生的影响；人们用于检测表达的抗体所识别的表位不同，与不同的膜蛋白形式的反应性不同。
    在所有HCV蛋白中，E2的保守性最弱。在E2的N末端有两个高变区（HVR），分别是HVR1（aa390-410）和HVR2（aa474-480）（Hijikata, et al., 1991b; Weiner, et al., 1991）。有证据表明E2蛋白是免疫反应的主要目标。当HCV病人接受干扰素治疗时，E2的突变增加，对于E1没有此现象发生(Zonaro, er al, 1994)；在慢性感染过程中，观察到HVR1序列在不断改变，针对HVR1序列的特异抗体也相应地不断改变（Shimuzu, et al., 1994）；E2含有两个以上中和抗体表位（Lechner, et al., 1998），其中一个位于HVR1（Zibert, et al., 1995）。哺乳动物系统表达的E2还被观察到和人细胞有特异的结合（Rosa, et al., 1996）。因此E2成了HCV疫苗开发的主要目标。
    和E1类似，位于E2羧端的TMD负责E2在内质网的静态滞留（Duvet, et al., 1998; Cocquerel, et al., 1998）。共表达的E1和E2形成非共价的异二聚体，在结合E1时起主要作用的序列位于aa415-500，两个HVR对于结合E1没有贡献（Yi, et al., 1997）。
    有了这些背景，当人们发现E2和细胞表面分子CD81之间的强烈的相互作用，并且，含保护性抗体的血清能阻断E2和CD81的相互作用时（Pileri et al., 1998），很多人便相信CD81是HCV受体分子，尽管没有证据表明HCV和CD81的结合导致病毒进入细胞。反而是有证据表明，HCV和其他黄病毒家族成员结合并通过低密度脂蛋白（LDL）受体进入细胞（Agnello, et al., 1999; Monazahian et al., 1999）：自由LDL能竞争性地阻断HCV和细胞的结合；原来不结合HCV的细胞在表达LDL受体后能结合HCV；提高LDL受体活性后观察到HCV等病毒的内吞也相应提高；并在体外实验中对多种细胞使用抗LDL受体抗体完全阻断了HCV的内吞。但是，用抗LDL受体抗体处理LDL受体缺陷的成纤维母细胞后，仍有少量HCV能进入细胞。看来抗LDL受体是介导HCV入胞的主要受体，但不是唯一受体。
    利用多种凝集素亲和柱对从病人血清中分离到的不同基因型的天然病毒粒子进行分析，发现所有基因型的病毒粒子表面的糖基都是N-连接的复杂糖型的糖链，这是在高尔基体被修饰的结果（Sato, et al., 1993）。这似乎和E2静态滞留于内质网膜有矛盾。Bartenschlager等提出的HCV复制模型（图2）将静态滞留于内质网膜的E2和病毒颗粒上经高尔基体修饰的E2联系了起来 （Bartenschlager, et al., 2000）。我们的实验结果支持该模型提出的HCV向内质网出芽而非向细胞膜出芽。在痘苗病毒表达系统中单独表达包膜蛋白只能得到糖化较少的E2蛋白，共表达核心蛋白则能得到75kD的高度糖化的蛋白。构建了多个缺失突变克隆，发现高度糖化E2的表达依赖于全长的核心蛋白序列，而E1的共表达则不是必需的（Zhu, et al., 2000）。其原因可能是共表达的核心蛋白能和内质网膜上的E2蛋白结合，形成假病毒颗粒，从而才能脱离静态滞留内质网膜信号的束缚，进入高尔基体得到进一步的糖化。


图2：HCV复制周期的假说模型。

    感染宿主细胞（大方框）后，正链RNA基因组被释放至细胞质，以之为模板进行翻译。继而所得的多蛋白被加工，病毒蛋白与内质网膜紧密联系。表达产物中的复制酶NS3-5合成负链RNA并以之为模板合成大量的正链RNA。正链RNA然后和核心蛋白相接触并被包裹为核心颗粒。此颗粒向内质网出芽形成病毒颗粒。病毒颗粒经高尔基体由分泌途径出胞。