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转移贴-请教:关于流感病毒感染MDCK 问题(药物筛选)

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发表于 2015-10-22 22:36:05 | 只看该作者 回帖奖励 |倒序浏览 |阅读模式
原帖由xuqz005 发表于31/5/2010 20:35
大家好,我是做基于细胞的抗流感病毒药物筛选研究的。我通常是将细胞传至96孔板中,次日感染后加药培养。在我多次的实验中发现,在感染细胞后,发现同一药物孔间差异很大,病变程度不一致,通过
检测上清中NA活力也验证了这一结果,我一般是设有三个复孔。请大家给点建议,感染剂量是10 tcid50,感染1h
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 楼主| 发表于 2015-10-22 22:37:42 | 只看该作者
cloud 回复:
我的一点经验:
1.细胞消化的问题:消化时间的掌握,我们一般T75的培养瓶,先把培养液吸干净,防止残留血清中和胰酶作用,然后用5ml胰酶洗一遍,中和残留血清,去掉一些死细胞,再加5ml胰酶放37度孵箱消化8-10min,消化时间的掌握要看细胞状态,是否长满,胰酶等因素,最好是镜下观察间隙变大细胞基本分开,但还贴壁,轻拍瓶子细胞流下最好。然后补10ml生长液,吹打10次左右,然后1500rpm/5min离心。弃去上清,轻摇或轻弹瓶底,使细胞打散,补10ml生长液吹打几下混匀后,细胞计数。
2.我们铺板的细胞数是3*10E4个细胞,下午或晚上铺板,待第二天早上长满70
%-80%(细胞处于对数生长期很重要)后,用PBS(常温)洗两遍后加稀释好的病毒悬液吸附40min-60min后用PBS洗一遍,注意换枪头或者从高稀释度到低稀释度吸出PBS
3.另外细胞代次一定不能太高我们一般都是20代以下
4.我记得这种抗病毒药物的研究好像用MOI定量的多一些,TCID50一般是用于做动物实验时病毒的定量

个人经验而已,希望对你的实验有帮助

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 楼主| 发表于 2015-10-22 22:38:06 | 只看该作者
xuqz005 回复:
谢谢,不知道你们感染后空间的病变是否一致,你们是怎么检测病毒复制水平的?

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 楼主| 发表于 2015-10-22 22:38:28 | 只看该作者
Johntl 回复:
我也是做抗流感药物的筛选的 大家爱可以交流一下 我QQ441675058  

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 楼主| 发表于 2015-10-22 22:38:59 | 只看该作者
yuanjian0415 回复:
我想请问下:抗病毒药物筛选的实验室主要方法有那些?可以给我名称就好,更希望具体分享下。谢谢  

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 楼主| 发表于 2015-10-22 22:39:30 | 只看该作者
荷塘 回复:
我觉得与细胞接种是否均匀,细胞的密度,以及病毒的感染量有很大的关系,你可以再调整一下方案  
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