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标题: 慢病毒滴度检测 [打印本页]

作者: niuhuanhuan55 时间: 2016-7-15 12:04
标题: 慢病毒滴度检测
本帖最后由 niuhuanhuan55 于 2016-7-15 12:06 编辑

Protocol:
1) 转导前一天（第 1 天），胰酶消化细胞并计数细胞密度，按照合适的细胞密度接种到 6 孔板中，能使转染当天的融合度达到 30%-50%。放置 37℃、 5%CO2 饱和湿度培养箱过夜培养。例如：如果用HT1080细胞测定滴度，通常一个六孔版的孔接种 2×105  个细胞；我用的细胞是HT29。
2) 转导当天（第 2 天），融解病毒，准备 10 倍稀释系列样品，稀释倍数从 10-2到10-6。对于每一个稀释样品，用完全培养液稀释病毒至总体积 1mL。避免漩涡震荡；
3) 去除细胞中的培养液，加入已含有不同病毒量的完全培养液。另外，保留一孔不添加病毒的细胞，作为空白对照组。注：每孔加入的培养液的体积应为 1mL；
4)  （可选）在含有病毒的培养液中加入聚凝胺，促进病毒感染细胞。轻轻地摇晃培养板以混匀聚凝胺。放置 37℃、5%CO2 饱和湿度培养箱过夜培养；
注：一般 polybrene 的储液浓度是 6mg/ml（用超纯水配制，－20 度储存，注意分装，反复冻融三次以上将大大降低效果）。工作浓度是 6ug/ml。
5) 转染后一天（第 3 天），去除含有病毒的培养液，加入 2mL 新鲜的完全培养液。放置 37℃、5%CO2饱和湿度培养箱过夜培养；
6) 转染后两天（第 4 天），去除培养液，加入含有适当浓度的嘌呤霉素的完全培养液以筛选稳定转导的细胞；
7) 每 3 天更换含有嘌呤霉素的新鲜培养液；
8) 筛选数天后，可以看到对照组没有活细胞，而添加过病毒的 1 个或者更多个的孔会出现药物抗性的克隆。去除培养液，用 PBS 洗涤细胞 2 次。注：筛选所需天数应以对照组的所有细胞死亡为准；
9) 加入龙胆紫染色液（6 孔板每孔 1mL）并放置室温孵育10 分钟；
10) 去除染色液，用 PBS 洗涤细胞 2 次；
11) 计数被染成蓝色的克隆数目，并计算病毒滴度。

我的6孔板（除了空白对照上什么都没有），都是蓝色的针尖大小的小点无法计数，只有在显微镜下可以看到被染成蓝色的贴壁细胞，和一些细胞碎片及染料沉淀。没法计算滴度，不知道各位有什么好办法？ [/td][/tr]
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作者: ipsvirus 时间: 2016-7-15 15:53
a.我都会在plybrene后会将板子1200g，离心30min，可以增加感染效率。
b.你的puromycin使用浓度在实验之前有确定对HT29的最低杀死浓度吗？对病毒感染后就用这个浓度去筛。有可能你用的浓度太高，所以细胞都死了，染出来的都是死细胞，即使成功感染的也不能生长。
c.直接数个数当成滴度不准。

作者: niuhuanhuan55 时间: 2016-7-15 16:47
多谢管理员的指导，

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