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标题: 急求sf9细胞裂解液 [打印本页]

作者: cao1976    时间: 2015-7-14 08:57
标题: 急求sf9细胞裂解液
原贴volcano发表于 2009-11-11 16:19
http://biosky.haotui.com/thread-12695-1-2.html

大家好,
我是利用Bac-to-Bac系统表达蛋白,载体用的是pFstbacHTB,现在处在表达阶段,打算用Ni-NTA纯化蛋白。根据protocal 上建议的配置裂解液,貌似效果不是很好。
不知各位能不能给个建议,有什么好的裂解液,如果能给个纯化的整套ptotocal那就更好了。非常感谢!

作者: cao1976    时间: 2015-7-14 08:57
atfsu15 发表于 2009-11-12 20:05 :我没弄过SF9,不过从裂解液上看也许可以商榷。

不论是50mM或者是100mM磷酸钠缓冲液,保证弱碱性pH的配方是,摩尔比Na2HPO4 : NaH2PO4 = 19:1,一般各自配成0.2M的储备液,用之前混合再调pH。反过来,保证弱酸性就要二氢钠多很多。

可以适当减少NaCl浓度,生理浓度是150mM。

可以尝试去掉咪唑,这个浓度是防止非特异结合的,但似乎NTA用不着。

你用的NP40是终浓度1%吗?感觉有点高了,但如果裂解细胞必须要这么多的话,建议可以先加1体积含1%NP40的裂解液裂解完成,再加9体积不含去污剂的缓冲液,甚至可以稀释更多一点,但其它盐浓度不要改。

在冰上孵育不是个好办法,为何不尝试超声破碎或者涡旋呢?不怕麻烦也可以用注射器小针头吹打。可以在裂解液中加不含EDTA的蛋白酶抑制剂。

你的方案最后会释放大量核酸,导致整个液体很粘稠,可以尝试加点Benzonase,在有蛋白酶抑制剂的前提下室温振荡15-20min,或者超声波裂解细胞。

可以延长柱结合时间,比如4度过夜。

当然最重要是你确定要的蛋白表达得不错,并且有结合柱子的那一段。

希望有点帮助,祝好运。
作者: olezi    时间: 2016-7-7 04:58
交流贴,继续努力发好帖
作者: Ascovirus    时间: 2016-11-24 23:12
找到了没有啊?




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