运输和保存方法 冰袋运输。 4℃干燥保存,1年有效;为了维持最好的产品稳定性,建议-20℃干燥保存,2年有效。 使用方法 1. 建议使用浓度 哺乳动物细胞:1-10 μg/mL,最佳浓度需要杀灭曲线来确定; 大肠杆菌:LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌,使用浓度为125μg/mL。注:使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的pH值调节,而且受宿主细胞本身的影响。 2. 溶解方法 用蒸馏水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/ml的母液,经0.22 μm滤膜过滤除菌后分装于-20℃冻存;也可溶于甲醇,配制成10 mg/ml的储存液。 3. 嘌呤霉素杀灭曲线的确定(以shRNA转染或者慢病毒转导为例) 嘌呤霉素有效筛选浓度跟细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢情况及细胞所处细胞周期位置等有关。为了筛选到稳定表达的shRNA细胞株,确定杀死未转染/转导细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。建议初次做实验的客户一定要建立适合自身实验体系的杀死曲线(kill curve)。 1) Day 1:24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板,铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。37℃细胞孵育过夜; 2) Day 2:a)准备筛选培养基:含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基(如0-15μg/mL,至少5个梯度);b)往孵育过夜后的细胞内更换新鲜配制的筛选培养基;之后37℃孵育细胞; 3) Day 4:更换新鲜的筛选培养基,并观察细胞存活率。 4) 根据细胞的生长状态,约2-3天更换新鲜的筛选培养基; 5) 每日监测细胞,观察存活细胞率,从而确定抗生素筛选开始4-6天内有效杀死非转染或者所有非转导细胞的药物最低浓度。 4. 哺乳动物稳定转染细胞株的筛选 等转染含有pac基因的质粒后,细胞在含有嘌呤霉素的培养基中增殖,以筛选出稳定转染子。 1) 细胞转染48h后,将细胞(原样或稀释)置于含有适当浓度嘌呤霉素的新鲜培养基中培养。 注意:当细胞处于分裂活跃期时,抗生素作用最明显。细胞过于密集,抗生素产生的效力会明显下降。最好进行细胞分盘使其密度不超过25%。 2) 每隔2-3天,移除和更换含有嘌呤霉素的培养基。 3) 筛选7天后评估细胞形成的病灶。病灶可能需要额外的一周或者更多时间,这依赖于宿主细胞系和转染筛选效率。注意:每日进行细胞生长状态的观察。嘌呤霉素的筛选至少需要48h,有效浓度嘌呤霉素的筛选周期一般在3-10天。 4) 转移和放置5-10个抗性克隆到一个35mm的培养皿中,用选择培养基继续培养7天。此次富集培养是为日后的细胞毒性实验做准备。 注意事项 1)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
2)嘌呤霉素为有毒化合物,操作时请小心拿放。
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