韩老师公布基因编辑的protocol了！

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A general protocol of NgAgo/gDNA-mediated genome editing

1. Cell culture
293T cells are maintained in high-glucose DMEM (Gibco) supplemented with 10% FBS (Gibco) and penicillin/streptomycin at 37°C with 5% CO2 incubation. When cells reach their ≈60% confluence, perform transfection.  Before transfection, cells are changed to medium containing 2% FBS（heat inactivated）. Since 293T cells are not firmly attached, be gentle and do not disturb cells when changing medium.

2. Transfection
2-1 NLS-NgAgo expressing plasmid is extracted with Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega), and is adjusted to 100 ng/μl in water (pH 8.0, alkalization by NaOH).  
2-2 5’ phosphorylated ssDNA guides are dissolved to 100 ng/μl in water (PH 8.0)  For each well of a 24-well plate, 200-250 ng NLS-NgAgo expression plasmid and 100-300 ng guides are diluted in 50 μl Opti-MEM (Gibco); 1.25 μl Lipofectamine® 2000 is diluted in 50 μl Opti-MEM.  Incubate the DNA mix and lipofectamine mix for 5 min.
2-3 Combine the DNA mix and lipofectamine mix with gentle pipetting and incubate for 20 min.  The DNA/lipo mixture is then added into each well of cells.  

*Since NgAgo follows “one-guide faithful” rule, i.e. guides can only be loaded when NgAgo protein is in the process of expression, to improve the efficiency of gDNA loading to NgAgo, sometimes multiple transfection of gDNA helps (e.g. depending on the different kinetics of NgAgo expression in different cells, a second transfection of gDNA can be performed 8, 12 or 24 hours after the primary transfection)
*As stated below, cells will be harvested 48-60 hours after transfection.  90% confluence of the cells on harvesting is ideal.  Cell overplating significantly weakens the efficacy of genome editing.  Taking HDR as an example, it occurs only during S and G2 phases.  

3.  Genomic DNA extraction
3-1 48-60 hours after transfection, cells are harvested by trypsin digestion.  Four wells of cells are combined into a 1.5 ml EP tube.
3-2 For genomic DNA extraction, 500 μl of cell lysate buffer (50 mM Tris，100 mM EDTA，0.5% SDS，pH 8) and 10 μl proteinase K (10 mg/ml）are added into each tube and mixed gently and sufficiently.  Bathe the tubes at 55℃ for 2 hours.
3-3 200 μl Tris-Phenol and 200 ul trichloromethane are added into each tube and mixed gently and sufficiently.  After incubation for 5 min, samples are spun at 12,000 rpm for 15 min to separate aqueous phase from Phenol phase.
3-4 Carefully collect the aqueous phase into a clean EP tube.
3-5 Repeat the Steps 3-3 and 3-4 once and pool the aqueous phase.
3-6 Add 500 μl trichloromethane into the collected aqueous phase, mix gently and sufficiently, stay for 5 min, and then spin the sample at 12,000 rpm for 15 min to separate aqueous phase from Phenol phase. Carefully remove the aqueous phase into a clean EP tube.
3-7 Repeat the Steps 3-6 once.
3-8 Add 900 μl EtOH to the collected aqueous phase and incubate at -20°C for 30 min.
3-9 Centrifuge the sample at 12,000 rpm for 10 min, and then the DNA sediment is washed with 500 μl 75% EtOH thrice.
3-10 Air-dry the DNA sediment, add 50 μl 0.5 x TE and then adjust the genome DNA to 100 ng/μl for later use.

Note:
1. NgAgo/gDNA system is extremely sensitive to contamination of intracellular bacteria (including mycoplasma) which are widespread and leave no visible signs of presence. Carefully excluding the presence of intracellular bacteria before performing experiments.
2. Because Agos need magnesium, avoid EDTA when detaching and seeding cells into the plates for transfection.  Alternatively, supplementing Mg2+ to 5 mM (may need optimization to your cell type).
3. Avoid using Lipofectamine® 3000 since the supplement P3000 interferes with ssDNA transfection. Lipofectamine® 2000 is a good choice. Other transfection methods such as electroporation are yet to be tested.
4.  Ideally, 5' phosporylation of ssDNA guide by using T4 PNK (Biolab):
T4 PNK                                  2 μl
T4 ligase buffer (containing ATP):          12 μl
1OD ssDNA (about 33 μg) in H2O:         100 μl  
(alternatively) additional ATP (25 mM)        2 μl
Add H2O to a final volume of              120 μl
Incubate at 37℃ overnight
After 5' phosphorylation, the resultant ssDNA needs no purification, dilute by water (PH8) to 300 μl with a final concentration of 10 nM or 100 ng/μl)

Full Sequence Map for nls-NgAgo-GK

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8月8日，河北科技大学副教授韩春雨向非营利性质粒共享信息库Addgene提交新版的详细实验方法，并补充了数项应当注意的问题。
此前，韩春雨领导的课题小组发明新的基因编辑技术NgAgo－gDNA，被国内媒体誉为做出“诺奖级”实验成果。然而，论文发表两个月后，全球仍没有一家实验室对外宣布能够完全成功重复韩春雨的实验，多国科学家要求发表韩春雨论文的《自然-生物技术》介入调查并公开实验中的所有原始数据和实验条件，该期刊表示将按照既定流程来调查此事。
10日，韩春雨独家回应南方都市报，表示其他科学家无法复制实验结果的原因，他也在研究，但目前不能随便下定论，必须有科学的结论才能发声。目前提交的新实验方法是在和其它科学家讨论之后得出的，其中最有价值的部分是提出了一些注意事项。
新版实验步骤有四处变化 增加四个注意事项
5月2日，韩春雨课题组的论文《NgAgo DNA单链引导的基因编辑工具》在《自然-生物技术》网络版发表，随后引起了广泛关注。韩春雨小组得出的结果是以DNA来介导NgAgo（一种核酸内切酶）对靶向基因的识别从而进行基因编辑，被认为是基因编辑领域的一项重大突破。
韩春雨因此走红网络，被许多人视为在普通学校也能做出一流科研成果、耐得住寂寞搞科研的典型样本。同时有观点认为，NgAgo将取代CRISPR成为新一代主流的基因编辑技术。不过，韩春雨本人对此相当谨慎。他曾在接受媒体采访时表示，NgAgo系统和CRISPR都为基因编辑应用提供了更好的工具和多样化的选择，各有各的用处。
然而，在论文发表后的两个多月后，没有一家科研团队宣布成功重复出韩春雨的实验结果，使得这项新基因编辑技术受到极大的质疑。
8月8日，河北科技大学副教授韩春雨向非盈利性质粒共享信息库Addgene网站提交新版的详细实验方法，南都记者看到，其中一些实验步骤与其在《自然-生命科学》中发表的论文有所不同。
据“科学美国人”中文版《环球科学》的微信公众号“科研圈”介绍，新版实验步骤有几处变化：
1.血清品牌由 Hyclone 变更为Gibco；
2.增加了关于“293T 细胞贴壁不牢，换液时要小心操作”的小提示；
3.建议在质粒/gDNA共转染的时间从“24小时”变成了8小时、12小时或24小时后；
4.溶解和稀释质粒及 gDNA 的缓冲液从含有 EDTA 的0.5xTE变更为水（pH 8.0）。
此外，实验步骤之后还有“在实验前要仔细确认所使用的细胞株未被污染或污染已被彻底清除”、“在细胞消化和培养过程中要避免使用金属离子螯合剂 EDT。也可以在培养基中额外加入 5 mM或其他浓度的镁离子”等四条注意事项。
有研究者认为，新版实验步骤第三条提到的补转gDNA和第四条中缓冲液的变化，尤为关键。
值得注意的是，实验步骤后补充的四条注意事项中， EDTA 再次被强调。据了解，EDTA是一种金属离子螯合剂，可以螯合镁离子，而根据韩春雨补充的说明，镁离子恰恰是 NgAgo 系统发挥作用的必要条件。有学者认为，此前多国学者无法重复实验结果，或许就是EDTA“神不知鬼不觉”地产生了影响。
新方法公布后 争议仍未止息
此前，由于多国科学家无法重复出实验结果，有人质疑韩春雨在论文中隐瞒了实验的关键条件。 “《自然-生物技术》应该要求韩向公众公开他所有的原始数据和实验条件，这是学术期刊的义务。”质疑者之一的布尔焦说。
新版方法刚刚公布，尚未有人公开声称调整后的方法有效。一位重复实验结果失败的国内研究者则对南都说，实验时确实没有注意到新版方法中涉及的细节，将在近期继续尝试。他对重复成功表示了审慎乐观。
但在NgAgo的谷歌讨论组内，争议仍未止息。名为Jonathan Geisinger的用户认为，新版实验方法并不具备足够的说服力。名为SL的用户则表示，问题的关键仍然在于韩春雨如何达到论文中21%-41%基因编辑效率，新步骤看起来不足以让那些重复实验失败的人将效率提高到20%以上。
《自然-生物技术》：暂未取得可公开的调查进展
8月8日，《自然-生物技术》发言人称，将按既定流程调查韩春雨的研究。“已有若干研究者联系本刊，表示无法重复这项研究，”发言人说，“《自然-生物技术》对于人们提出的任何关于论文的疑虑都会认真对待，并加以慎重考虑。”
发言人同时表示，作为在自然科研旗下期刊发表论文的条件之一，作者须将材料、数据、代码和相关的实验流程及时向读者提供，不可加以不当限制。
有研究者认为，韩春雨新公布的实验方法发生了变化，但这并不意味着韩春雨违反《自然-生物技术》的要求，在此前的论文中隐瞒了实验的关键条件。
以新步骤中缓冲液的变化为例，这名研究者说，基因编辑的实验中，用水和含有EDTA的0.5xTE做缓冲液都很常见，大多取决于研究者的个人习惯，可能正因为此，韩春雨在此前的论文中没有特别强调避免EDTA的影响。
10日下午3时许，《自然》工作人员对南方都市报记者表示，目前韩教授没有将最新的实验方式提交给杂志社，因此不好发表评论。此外，对于期刊此前声明对韩春雨论文的调查，暂时没有可以对外公开的进展。
独家对话韩春雨
10日，韩春雨独家回应南方都市报，表示新提交的实验方法，当中最有价值的部分是提出了一些注意事项，如避免细胞的污染。韩春雨称，这些新的实验方法是在和其它科学家讨论之后得出的，此前自己只是从自己的经验、习惯出发去撰写实验方法，对别人可能遇到的问题考虑不周全。
韩春雨对南都记者表示，其他科学家无法重复的原因，他也在探究，但目前不能随便下定论，“重复性到底是由什么决定的，比如我们认为是细胞污染，那我们必须有科学的结论才行，要拿出证据，不能随口一说。”
韩春雨认为，这些研究工作并不是他一个人的责任，所有的科学家都可以做的，“这一个东西提出来之后，其实就是提供给全世界了，让全世界科学家一起去解决这里面的问题。”
对于是否有人已经复制成功，对实验结果是否仍然有信心，韩春雨表示，《自然》的最新报道是最全面的，除此之外均不作回应。
南都：最近你向质粒共享信息库 Addgene 提交了更详细的新版实验方法，其中补充了数项应特别注意的问题。为什么会作出这些改变？
韩春雨：第一个关于血清的品牌的改进并不重要，只要保证是热灭活的血清就可以；第二个补充DNA guide时间，这是要根据细胞的传代速度和蛋白表达时间来决定的。每个实验室里的细胞都不同，所以需要根据实验用细胞的蛋白表达时间去补加DNA guide，这个是需要摸索的。而以前的方法是根据我当时的实验确定的；第三个改进，将缓冲液从含有 EDTA的TE换成PH8的水，主要是因为NgAgo需要镁离子，我们要尽量去掉所有含有EDTA的试剂。
南都：此前为什么没有提出这些注意事项？
韩春雨：通过最近和其他一些研究者交流，我认为这些可能会被研究者忽视。
南都：最新提交的实验方法与原来的实验方法有什么不同？
韩春雨：原则上没有本质区别，但增加了需要特别注意的事项，例如避免使用污染的细胞；还有一些细节，例如如何磷酸化ssDNA，以及避免Mg离子损失。
南都：这次提交新的试验方法，最重要的价值在哪里？
韩春雨：新的实验方法当中最重要的部分是根据实验室经验提出了一些注意事项，排在前面的是最重要的。在我们注意事项中的第一点，就是NgAgo系统对细胞的污染，包括支原体、寄生菌的污染极其敏感，避免使用污染的细胞。
南都：你认为是细胞的污染导致很多科学家无法复制你的实验吗？
韩春雨：其他科学家无法重复的原因，我们也在研究。但必须要作出科学的结论来才行，不能随口一说。比如用污染的细胞和不污染的细胞对比，以及这些污染到底是什么。
其实这个工作是所有科学家都可以做的。比如说他会去研究污染如何对NgAgo系统起作用，可以作为科研论文去发表。我们的经验分享给大家，别人有经验也可以去分享，这就是科学的态度。
南都：你是怎么得出这一新的实验方法的？
韩春雨：这是跟别人在讨论当中发现的，有一些我们也在优化。一个技术出来，它的优化是需要不断进行的，每次都可能有一些小的进步。比如在细胞培养液中添加镁离子效果更好。
南都：为什么选择Addgene这个平台，而不是原来发表期刊的《自然-生物技术》？
韩春雨：这是两个不同的渠道，Addgene是一个非营利机构，主动联系我们的，他们希望我们提供一份详细的protocol，所以我就提交了。这是一个研究人员共享的平台。
事件回顾
5月2日，韩春雨课题组的论文《NgAgo DNA单链引导的基因编辑工具》在《自然-生物技术》网络版发表；
5月-7月，研究成果受到学界和社会的广泛关注，韩春雨走红；谷歌在线聊天群组等网络社区内，无法重复实验结果的质疑声也陆续出现；
7月14日，方舟子发博文质疑韩春雨，称国内多家实验室反映他们重复不出韩春雨论文的实验结果；
7月29日，一度对重复实验表示乐观的澳大利亚大学研究中心学者盖坦·布尔焦（Gaetan Burgio）公开发文称无法再现韩春雨论文的结果，将质疑声推向高潮；
8月2日，《自然-生物技术》宣布将按照既定流程对研究进行调查；
8月8日，韩春雨向质粒共享信息库 Addgene 提交更详细的新版实验方法，其中补充了数项应特别注意的问题。

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