[讨论交流] 搜集些实验中的小技巧

donggua

实验中有些小技巧看起来平平常常，但作用也不能小看，发此帖来收集下。

donggua

转自 生物谷  

实验室日常小技巧集锦
平时在实验室最常听到的一句话就是“今天某某试验没做好是为什么？今天某某试验没出结果是什么原因？今天某某试验为什么会是这样的呢？” 等等。然后仔细一查找原因，往往是由于操作上面的不认真，或是一些小小的细节没有注意到。以下是集各路朋友的一些经验，与大家分享：
1跑page胶的时候，小电压跑会避免高电压产生的热量尔导致的胶层变形。低电压泳道会比大电压泳道跑的直一些，且分离效果更高，有利于分子量相差不大的蛋白分离。
2. 提取质粒的时候，最后一步的酒精挥发很关键，基本上是其后续的酶切反应的决定性因素。所以这一步尽量挥发长一点时间，最好是空调吹热风，或是37度温箱放长一点的时间，我试过室温过夜，酶切很好。
3. 做WESTERN BLOT 的时候，大家往往会摸索一抗、二抗的浓度，封闭时间，曝光时间等等，而每次变换其中的一个条件就需要从新跑胶、转膜，甚至重新提蛋白，这样会浪费大量的时间。其实完全没有必要这样。一次转膜后，将PVDF膜晾干，裁减成小块，保存起来，用的时候取出一块，没有任何影响。这对于摸索条件的战友来说，节约了大量的时间。
4. 有关缓冲液和培养基配置
1）将缓冲液配方中的成分分别以10－100倍配成母液储存，需要的时候只需将相应的母液混合，补加水稀释即可
2）配培养基时通常会忘记各成分的量，如配LB时的三个成分不记得到底哪个是5g，哪个要10个，因此可以在常用的试剂瓶的标签上注明所需的量，如配LB时，在NaCl瓶外注明10g/L, yeast 5 g/L, tryton 10 g/L等，很方便，不需要每次配之前临时翻书
5. 有关PCR主反应液配置:
在做克隆鉴定的时候经常需要在酶切鉴定前进行PCR鉴定，每次配置PCR反应液很繁琐，可以将其配置类似kit的形式，按你需要的反应体系列表，然后放大100倍配置100×主反应液（100次反应），其中含buffer，Mg2＋，dNTPs，但不含引物和Taq酶，然后可以10×分装或一管储存在－20度，在需要的时候拿出融开，然后按所需的PCR反应个数吸取相应的倍数，再补加相应反应倍数的Taq和引物，混匀后分装，这样做的好处如下：
1）可极大的节省宝贵的时间，可早点收工，看球
2）避免每次反应加样不均的可能
3）大大减少PCR假阳性的产生
6. 有关酶切反应液的配置:
在做酶切时，也可以象PCR一样配置主反应液，每次反应前先列好反应的体系，算好需要的反应数，然后按所需反应的体系按所需反应数放大，加入buffer、酶、水，质粒栏空缺，然后混合后按除质粒DNA的体积分装，然后再在每管中加入相应体积的质粒DNA酶切，这样做的好处如下，特别是当同时有10几个阳性克隆需要鉴定时尤为明显：
1）各反应成分均一
2）可大大减少限制型内切酶的使用
3）节省时间
7. 有关SDS－PAGE：
1）可将SDS－PAGE的积层胶，分离胶预先配好大体积如100ml储存在4度冰箱（注：10％AP，TEMED不加，切记！！！），每次配置时只需吸取相应体积的预制胶加入AP，TEMED即可，没必要每次制胶时候翻分子克隆，特别方便，而且，这样的预制胶可储存半年以上，不失为偷懒的绝佳方法；更关键的是可大大减少与丙稀酰胺的接触，因此大大减少中毒的机会。
2）电泳时虽然小电泳分离效果要好一些，但2小时以上的等待的时间实在是痛苦，因此可以提高电泳至150V，但需要将整个电泳槽放在放满冰水的脸盆里散热，这样跑出来的胶分离效果丝毫不比低电压来的差，关键是时间大大节省，不需1h即可看结果了
8. 实验中小窍门我想能够分成两类：一类是“非常规”操作；一类是常规操作过程中一些省时省事手段。
前一类，我举个例子：有时候第一天涂的转化平板、次日早晨转化子可能长成的菌落比较大（1~2毫米以上，BL21就长得快），下一步转化子做质粒鉴定。这个情况下可以直接挑取一块菌苔（勿带出培养基），50微升酚/氯仿悬浮菌体，放置两分钟，加40微升TE抽提，上层TE吸出后再氯仿抽提一次，吸取上层TE即是质粒提取液。提取的质粒可以直接用于电泳和酶切。这样操作，可以省去转接液体试管的培养步骤，至少节省6~8小时的时间。但是，要在各步骤都控制得很好的情况下才能保证提取和酶切的效果，不同的实验室或者操作者未必能够很方便地重复----其实，其它的一些“小窍门”也是如此。
后一类的小窍门则在实验室中无处不在。如：平行作不同样本的PCR,模板DNA加量一样，配置PCR体系可以一起配制后分装----这点做过试验的都知道，但是配制的时候配制量可以比预期分装量稍多一点（如用100微升则配110微升），这样可以避免有时候分装不够的尴尬，因为不同特别是大小不同的枪，会有误差。再比如：楼上有站友说的sds-page胶预配（APS和TEMED、或者后者先不加）的问题，实际上时间放置过长肯定影响效果，如果要在一天内连续地跑两次板，何尝不可？又比如，配sds-page胶的时候，上层胶和下层胶可以只用一个大枪头：先取胶，次取水，取6.8的tris后再取8.8的tris，省时省料。
20021108站友开的这个帖子很好，在上上层楼的帖子说得也有道理。但我想，“窍门”和“偷懒”不应该是因果关系。其实，不管是那一类的小窍门，都是在充分地理解实验各步骤的原理、经过多次试验积累、再加上一点点思索然后尝试的结果。知其然知其所以然和勤于思考敢于探索，是根本。否则，别人的小窍门对你也未必能够有用。才进实验室的新手，务必要先练好规范扎实的操作，然后才能弄“窍门”。本末倒置，贻害无穷。
9. 我一直是把SDS－PAGE的积层胶，分离胶预先配成mixture，APS制胶时加入，半年内使用，绝对没有问题，我保证。
10. 做SDS-PAGE的时候，除了蛋白量上样一致，最好体积也一致，这样跑出来的胶各个泳道之间的band能做到一样宽，方便后面的比较，特别是WB。做法就是拿1X的上样缓冲补全要加的样做到体积一致，否则跑出来会有的宽有的窄，特别是上样体积相差较大的。
11. 在把蛋白胶做成干胶时，很多时候会因为有气泡使胶裂掉，我的经验是在做胶时加上层膜前在胶上多加些水就不容易进气泡了，还有就是高温烘胶，我喜欢放到60度烘箱里烘，这样水分蒸发速度快，即使有一些小的气泡也不会有影响，呵呵，这是经验之谈，我从来都没失手过，大家可以试试
12. 做大肠表达时确定蛋白是否表达一般要煮样做诱前诱后检测,但很多时候煮出来的很黏影响跑胶效果.我发现如果现用8M Urea重悬细菌再煮效果会有极大改善.
注:不能用Gu-HCl代替
13. 我也推荐几个偷懒的方法
1 做SDS-PAGE跑胶通常都是现配现用,但配胶要>1h,所以如果想第二天睡个懒觉而又不耽误跑胶可以于前一天晚上做好浓缩胶和分离胶,待凝聚后不要拔下梳子,把含胶玻璃板从制胶槽取下,用保鲜膜包上,注意玻璃板上下两边缘会有气体,所以需要加一点电泳缓冲液以避免胶内水分蒸发.然后放4度过夜.第二天直接拔下梳子行后续.国外好多公司出售脚既是如此,可以保存上星期.
2 配置分离胶或者非变性胶时因胶凝时收缩可导致加样孔变浅.可以将加剩的胶放入4度以降低凝聚速度,而将凝胶放入37度促聚,并随时用4度加剩的胶补充下降的胶面.另外将胶横放与水平面成~10度角也可以减少收缩的影响.
3 推荐一个节约抗体/时间的做法:
同时跑2块胶,同时转膜,然后两块膜背靠背放入同一封口膜同时封闭,同时一抗二抗(最好是用转轮,这样效果好.如果是摇床,隔一段时间帮它们翻个身以保证两张膜的正面都有机会与液体充分接触.一起洗膜(可以稍微加强洗膜也可以不做.我最多一张盘子里放4张膜而没有影响洗膜).可分别或同时压片.这样就可以节约一半抗体和接近一半时间而不会影响结果.
或者另外一个就是孵育后的抗体不要扔,好的抗体可以反复做好几张膜呢.但每次都会减弱,效果不如上面一种方法.
14.做western blotting 转膜时，胶放在转膜缓冲液中一段时间，待胶在含有甲醇的缓冲夜中缩小的差不多后装好转膜装置，我的经验是把膜印在胶上直接在膜上画出预染maker条带，方便的很。因为很多时候跑电泳时胶上的预染maker很清楚，等转膜后就不是分辨的很清楚了。不过要注意画好预染maker后就不要使胶和膜发生对位移动了，以防maker失去参照价值。
15. 超滤最合适用于蛋白的浓缩，更换缓冲液和除盐，对于按照分子量进行初分离的效果不是很好，理论和现实是有很大差别的^_^
16. 关于Western Blot
1）器具的清洁非常重要，开始做前，为了安全，尤其是装胶的厚薄玻璃板，可以先用中性洗涤剂和自来水反复冲洗，确保无洗涤残液后用蒸馏水冲洗2－3遍，然后用去离子水冲洗一遍。最后用95％酒精再擦一遍后晾干备用。
2）配胶最好现用现配，先配下层胶（分离胶），后配上层胶（浓缩胶或积层胶），而且在临灌胶前加APS并迅速混匀，即用移液枪抽吸与注入1－2次即可。
17跑蛋白page的时候，一开始用加样针，太麻烦，发现用20ul枪+普通小白枪头点，非常省事。另外，点样时有可能看不清孔在哪，看远离你的那面胶，孔有反光的。点样也点你对面的那块胶，省的总低头，干咱这行的容易得颈椎呀，爱惜自己。
18. 垂直电泳时，可在电泳糟中放入青霉素小瓶等，可自然使液面提高而不影响电泳，又很节约电泳缓冲液。
19. 我们有时要沉淀东西时，由于沉淀量很少，离心完之后不知道到底有没沉淀下来东西，由于量很少，不好观察，所以离心时建议按特定的方向放置离心管，这样你就可以在离心之前确定沉淀该沉淀到管子的大致部位，这样离心后就可直接观察那有没有沉淀，避免满管子找，另外看沉淀时可以对光看，这样就是颗粒状的细小沉淀也能看见的。
20. 大家都知道PMSF有剧毒，以前都是知道浓度和要配的体积的基础上,算出要称多少毫克的PMSF,其实也可以先称PMSF,称多少算多少,再调整异丙醇的体积，到达你所要的浓度。这样就避免了你长时间和它接触。
21. 跑好SDS-PAGE胶的一些体会。
1. 清洗好玻璃板，不要偷懒，很多时候跑完电泳撬胶时会因为玻璃板不干净胶粘在板上把胶撬破。
2. 配胶时不要反复用枪混，稍微摇混就可以了，用枪混多次会导致胶凝不好影响电泳图的分辨率。
3. AP分装成500微升一管保存放-20度，避免AP用太久失效。
4. 倒胶时把玻璃板中的水用滤纸尽量吸干，因为微量的水存在会影响配的胶浓度。
5. 尽量不用过夜放室温或者四度的胶，也回影响胶 的分离效果。
6. 电泳完撬胶时根本不需要用撬胶板，在一平皿里装好水，把有胶一面的放在水中晃动几次胶很容易就脱落下来，一点没有问题，方便的很。
7. 点样时样品别忘了离心这步，因为上样含有固体沉淀会影响电泳图分辨效果。
8. 尽量在冰浴状态下跑。
22. 做　２－ＤＥ　做的比较多，总结了几个小窍门：
１．一向电泳时，盐离子容易聚在　胶槽的两侧．剪一小段ＩＰＧ胶条放在　　两侧，构成盐桥，电压就容易上去了．避免一向电泳不好影响最后实验　　结果．
２． SDS－PAGE时,在灌胶之前,一般大家都会用凡士林封底, 在SDS－PAGE
电泳之前又必须把凡士林搽干净,很是麻烦,我的经验是:不用凡士林,取少量未加Ap的分离胶,按比例加2倍量的Ap,然后灌入板间,等上几分钟,待胶凝固后就可以接着灌分离胶了.方面,效果好!
23. 蛋白质纯化时，蛋白质降解可能与超声破菌保持冰浴有关，之前建议加pmsf，建议在上柱子洗脱的时候也加pmsf（蛋白降解抑制剂），一定要用之前再加。
24. 做透析的时候，拿一个5ml的枪头或者是其他类似的东西，剪短，穿过个塑料泡沫之类的面积比烧杯大东西，然后把透析带一端扎紧，另一端开口绑紧在5ml枪头下端，扎紧得那端也可以弯过来绑成u字型。这样就可以用1ml的枪穿过5ml的枪头的孔，另一只手调整透析带，来加样取样，省去了总绑透析带的麻烦，对同一个蛋白大量多次透析非常方便
25. 第一次发贴说一下自己的小经验，希望版主能给我一分，每次看到好东西因为没分都没法下，好羡慕有分的人啊。当然也不能不劳而获，说一下自己的实验技巧给大家分享。
1. 配SDS-PAGE胶时，用枪头混匀比较麻烦，而且费时费力，效果也不好。可以剪一小段夹文件的那种曲针做转子放到配胶的小烧杯里，在磁力搅拌器上边搅边加入各溶液，这样加完也就混匀了，直接灌胶即可。
2. 上面的站友也说过，上样用黄枪头就行，我也一直在用，根本不用注射器，方便的很，建议大家也试试。
3.电泳后考马斯亮蓝染色一般要1h到2h，脱色也要2h左右，麻烦的很。现在给大家说一个简单的方法，是我从一个师姐那里学到的。
加入染色液后，先放入微波炉里加热5-10秒，使染色液微热即可（千万不要加热太久，否则冰醋酸就挥发了）。然后放水平摇床上摇20分钟，最多半小时就染好了。
脱色也很简单，不用脱色液，直接用去离子水，放微波炉里煮沸5分钟左右，然后将水倒掉，再换上新的去离子水煮，这样反复几次，就可以了。效果可能比正常的脱色稍差一点点，不如那样清楚，只要电泳时比平时多上1/5的样品就可以了，关键是这样省时省材料（用不着含甲醇和冰醋酸的脱色液）。方便快捷！
放心，反复煮胶不会把胶煮坏的。
26. 我也说说我的小经验。可能大家都知道，请别笑话我。
1、配胶时一定要掌握好时间，不要因为过度赶时间，而造成以后的条带粗大，压不成条带，且消耗很多试剂和时间。
2、加样时，冲洗加样器可用双蒸水，用电泳液会使加样器中有很多的泡沫。或许是因为SDS的原因吧？
3、对于大分子蛋白质，转膜过夜更好。滤纸的张数可以适当减少。
4、在跑样时同时加入MARKER有助于正确识别所需的蛋白位置，减少NC膜的消耗。
5、一抗、二抗的浓度不要太高。
6、做ECL显影时，根据荧光的亮度调整时间。泡完显影液，胶片应用水洗一下，以减少定影液变黄。
7、和有经验的同学交流，也是非常重要的。知识的交流绝对有助于试验的成功。
这是我目前的一点拙见。
27. 推荐一个省质粒试剂盒硅胶柱与溶液的方法：
所有试剂使用手提质粒自己配置的溶液一、溶液二、溶液三（代替试剂盒的solution1、2、3），然后一比一的与饱和碘化钾或碘化钠（代替结合缓冲液）混合，就可以让质粒在硅胶上结合，而试剂盒的硅胶柱可以重复使用，没有试剂盒溶液量的限制，只要是一样的质粒我想提几管就提多少。
顺便说一句硅胶柱也可以用自己买的硅胶粉末代替，离心后倒掉硅胶柱上面的上清就可以，用起来不象柱子方便。效果比手提的要好要快。
28. 做WB时,样品比较多, 又怕放时间长了对蛋白样品不好,而且确定以后肯定要做某个抗体,只是一时没有决定.那么你可以选择先做SDS-PAGE,并转膜. 然后把PVDF膜凉干, 放四度保存. 以后拿出来封闭后,加抗体就行了. 蛋白在膜上,且已经分离, 比保存在BUFFER里面的蛋白肯定更可靠。呵呵
29. 今天作his纯化的时候，又琢磨了一个窍门，与大家分享。我得样品比较多，几百ml，而柱子不够大，只有10几ml，跑来跑去的上样，还总得记着，太麻烦了。于是，我就刷干净了一个烧杯，装了我的样品，找了一个细胶皮管，当连通器，就像鱼缸换水一样，用5ml枪在一头一吸，液体流出来，放到纯化柱里，调好烧杯的位置，两个液面一样平了，呵呵，上了好几个小时了，没有问题，现在调低速度，过夜上样：）
30. 能导致PAGE胶不凝的原因主要有三个：
1、配胶中用到的主要试剂的配置。
主要就是30％的丙稀酰胺的配置。粉末状的丙稀酰胺和甲叉丙稀酰胺使用不应该超过一年，因为丙稀酰胺会吸潮水解，这样以来丙烯酸的含量就会加大，从而导致page胶不凝。
2、温度。
温度高时凝固快，但是亦不宜过高，因为温度变化会影响交连物的孔径大小。所以温度在25度最为合适。
3、氧气。
氧气是凝固的终止剂，所以不能让胶中出现气泡。
虽然都是些看起来听低级的错误，但是不注意还是会犯。
31. 我做2维蛋白电泳，也有些心得：
1、向电泳玻璃板内加入胶条时，先在缝隙中加入配好的溴芬兰缓冲液，要加满，再将胶条贴后面玻璃板壁用薄塑料片将胶条缓缓推下至凝胶上缘，这样可以很好的避免胶条下形成空气泡。
2、能做出好的图谱已经很不容易了，如果在扫图时撕破实在可惜，所以扫图要小心，将凝胶转移到扫描仪时可以用塑料隔片在下面托着，同时保持有些水，这样就安全多了。
32. 凑个热闹说两句吧
1、sds-page胶如果配好装好倒入内槽液以后，发现内槽液稍有渗漏，可以把外槽液多加一些，加满，加到与内槽液相齐，这样就可以继续正常跑胶，不用浪费已经加进去的内槽液
2、至于染色脱色的问题，我们这里一直是染色：加热半分钟，摇20分钟；如果染液不是新配的，就加热半分钟摇十分钟，凉透了再重复一次即可
脱色也一直是用去离子水煮两三次即可
3、不知道大家都是怎么做酶切的，我的体会是，酶切质粒时，两个酶分别单酶切比直接双酶切效果要好很多。我有一次双酶切两次都没连出来，后来分步单酶切，连接效率几乎100%。
可以第一个酶切完后直接把体系热失活，（根据酶说明书上一般是65度20min）然后直接向里面补第二个酶
或者第一个切完后用氯仿抽提，把蛋白提出
或者中间做一次回收，这个就要考虑回收效率和损失的问题了，但是这样除蛋白最彻底
前两个方法我们这都是有人做过的，已经都很好用了
33. 俺也来说说关于Bradford法蛋白浓度定量和DTNB法巯基浓度定量的一点体会：
我是做蛋白修饰巯基后，通过这两种方法的定量来间接反应修饰的程度。一路摸索过来，也有半年有余；最大的体会就是不要急于求成，直接实验，首先检测修饰体系是否对方法有影响，修饰基团是否会在595nm和412nm下有特定的吸收，修饰后修饰试剂本身是否会有变化，对蛋白整体结构造成影响，其次再谈具体修饰比例和程度。对于巯基浓度测定方法，有四种（Anal Biochem. 1998 Dec 1;265(1):8-14），而DTNB本身虽然灵敏度不高，但是重复性和抗干扰是最佳的了。
34. 考马斯亮蓝染色后的脱色，如在脱色液中加数张捏成条状的Kimwipes纸（国外实验室常用，相当我们的擦镜纸，全棉纤维制造），由于染料吸附到纸纤维上，脱色加速。待纸着色较深时，更换新纸条，不用换液。我想脱脂棉或纱布也是一样的。但滤纸等可能不行，会溶掉。
半贴壁细胞如SP/0或杂交瘤细胞传代时，不用吹打或刮落。先将上清吸出，适当拍打培养瓶（当然是塑料瓶，玻璃瓶拍碎了别找我），即可见贴壁细胞脱落，加培养基混悬即可。注意，过力拍打培养瓶会裂，特别是瓶颈。
35. 一向电泳时，盐离子容易聚在　胶槽的两侧．剪一小段ＩＰＧ胶条放在两侧，构成盐桥，电压就容易上去了．避免一向电泳不好影响最后实验结果．
36. 我也推荐几条：
1、关于20021108战友的说法，我觉得我们制备好了一批感受态，最好马上转化一种已知质粒，与此同时，取一点感受态接种到含抗性的固/液体培养基培养来做对照。这样第二天即可以知道这批感受态是否还有外源质粒，又可以知道这批感受态转化效率的高低。如果合格，那以后就可以放心使用！因为我也曾经遇到其实是因为感受态不好而导致试验不成功，但是当时不知道，结果费时费力。
2、做克隆挑斑时，我们可以在将沾有菌体的牙签丢到试管前，在一块相应抗性的平板上点一下，标注清楚，培养时间稍长一点，待长成较大菌落后收取。以后需要哪一个菌,就在平板上挑取。这样既方便快捷，又可以保证菌的一致。
3、抽提质粒时，加入Sloution II和III后要求轻柔混匀。我个人觉得不用这样，只要不是非常剧烈，可以快速混匀。尤其可以运用在一次抽提多管质粒的时候，这样可以快速，而且效果一点也不差。
4、抽提质粒时，用无水乙醇沉淀的时间可以由实验操作者来决定，如果时间充裕可以30min，否则8-10min也可以。至于温度，个人觉得-20度好于常温。如果加入可醋酸钠，会较容易形成盐类杂质，所以时间短一些更好！
今天想到这些，先写到这里，以后想到了在上来与大家分享。希望我的小经验对大家有所帮助！
37. 首先声明：实验中的一些技巧要用在首先对基本的操作有深刻了解的基础上，在力求省时、省力、节约成本等的同时，实验的准确性是最重要的。
对大多数做蛋白的战友们来说，培养细胞应该是不陌生的，我这里谈一个培养细胞的小技巧，大家知道，对于一定的空间（如某种尺寸的细胞培养瓶）来说，细胞数目太多或者太少都不利于其生长，太多了就要消化，太少了要换一个小点儿的培养瓶，我的做法是：如果细胞数目太少，可以不必去找小一点儿的培养瓶，可把原来的培养瓶由原来的平放改为竖着放，这样底部的空间就小了，有利于细胞的生长，当细胞数目增加到一定程度的时候还可以在平过来，避免了来回换培养瓶而增加污染的机会（对没有小培养瓶的更实用）。
个人体会，仅供参考。
38. 说说关于SDS-PAGE的几个小经验
1、做好胶后，把所有的加样孔都加上样，这样可以防止边缘的样品脱尾。
2、高电压/高电流电泳时，可以把电泳槽放到4度冰箱中进行电泳，省时省力，1hr搞定。
3、胶考染时间40min，放在凝胶摇床上（没有胶床可以放到28度普通摇床上，但要控制好摇床速度）缓缓摇动，使染色均匀，同时可提高检测的灵敏度，根据我的经验可以达到银染的级别，就是脱色时间比较长，一般需要脱色2－3d，夏天的时候要勤换脱色液，防止变臭哦
39. 质粒小提如果是用作鉴定或酶切，不必进行酚仿抽提，将溶液1.2.3 离心后的清液移入一个新的1.5ml离心管中，再次离心3-5分钟，小心取出上清液后，直接沉淀，不必担心DNA切不开，我已经这样使用一年多，没出过什么问题。当然这样的质粒不很干净，但是做鉴定足够了。尤其是实验室女同胞们，可以减少酚仿的侵害，而且节省时间。

分子生物学当中的经验教训及技巧[copy](2009-03-23 15:02:08)
大家平时做实验，肯定都有很多小的技巧，在书上都看不到的，也没有系统的整理，但是确实能够起到很好的作用，不妨在这里与大家分享一下。
任何专业任何点滴的东西都行，也许就对别人有一点好处哦！
举个例子：
我在用酶标板加样的时候，蛋白样品常常会产生很多气泡，如果做荧光实验，由于灵敏度非常高，一点点微小的气泡都会影响很大，常常又不可能加消泡剂，我就用卫生纸，撕下来一下条，搓成小针，碰一碰气泡就破了，很好使：）
1、酶切或者PCR体系混合好以后，大家都会用手指轻弹EP管的底部来混匀溶液，常常出现很多气泡。这时候轻弹液面上方的管壁，消除气泡就轻而易举了。千万别弹液面下方的，气泡会越来越多。
2、CR不要一次做太多样品 有时候机器不稳定 影响结果
3、用卫生纸是一个，我觉得最好的是用接种针烧热了之后去戳一下，防止被卫生纸污染哈
建议瞬间离心一下是最好的，不但消除气泡，还有将管壁上的液体离下来，否则可能不够分装
4、卫生纸主要成分是纤维素，一般并不会污染样品，除非你做分析实验，之所以用卫生纸是因为它会吸水，减少水的表面张力，很容易就让气泡破裂了
5、磁珠回收时，不要贪多，收集上层即可，太过影响DNA的纯度和质量，对链接、转化有影像。
6、各种buffer都要完全融化后才能用，而且不管什么药品，如果只剩下最后一点底子了，最好放弃，因为可能会影响你的实验
7、动手前，一定要思路清晰，尽量把要做的事情列出来
8、做前一定要在笔记上写上1、2、3.....，在按照笔记一步一步做，否则容易出错。
9、要加的酶阿，dNTP，水啊之类的能分装的话最好分装好一点，万一污染的话就全完了
10、实验前,列个表单,列明关键点.避免出错.这样费一点时间是值得的.不要太相信自己的记忆.
孤风逐日：任何试剂反复冻融对其效率都有很大地影响。所以买来的试剂第一次使用时要注意按每次实验用量分装保存。提取的模板或纯化的样品也最好分装保存，以备不测。
很多个人经验在个板块相关分析中都有一些提及，只要多加留意就可以学到很多高手的不传经验。
11、同时做很多管PCR时的加样技巧
例如，需要做n管PCR：
    1. 如果用同一对引物扩不同的模板，可以先按照事先确定的比例，按照n+2的量把水，反应缓冲液，dNTP，镁盐，引物和Tag酶先加到一个大管里面，混匀后就是“预混合液”了，然后把“预混合液”分装到做PCR用的小管里面，通常我会分装n+1管，最后向前n管里面入模板，混匀，最后一管不加模板而是加入和模板等量的无菌水，作为对照，以检查加样过程中是否引入了污染，接下来就可以进行PCR反应。
    2.如果用不同的引物扩同一模板（不做多重PCR），则将第1点的引物和模板次序调换即可。
    3.同理，如果用不同的引物分别扩不同的模板，则将引物和模板留在最后分装后再分别加入。
这样做的优点：可以大量减少取样次数，减少了不同PCR管之间的误差（这一点对于荧光定量PCR尤其重要）；节省时间。
缺点：如果在制备预混合液时的任何一步引入了污染则会导致这一批次的所有PCR反应都被污染，所以我每次都做一个阴性对照（用无菌水替换模板），以检测是否被污染。
12、如果遇到试验有很多步，只是自己看protocol做，没有人带而且是第一次，我建议确立好步骤，然后每做一步的时候只注重眼前这一步，认真的做，不出错。这样每一步都只是关心眼下，可以集中精力，并且每一步都保证无误，最后结果应该不会太坏，而且即使出了问题，可以排除操作的因素。
13、跑PAGE胶染色的技巧吧：
其实是我自己的亲身体会，大家都知道如果严格按照protocol上的去做不但浪费药品，也浪费时间，程序还繁琐，当然代价也高些。
1、如果你跑的是小板的（SSR之类的分析足够），那么先找来4个1升左右的空塑料瓶，洗干净（我用的是上海国药的装尿素瓶，带盖的），用来分别装银染要用的固定液、染色液（硝酸银）、显影液、纯水，在每个上面分别写上名字，以免弄错，每次回收这些溶液后，把盖子拧紧，以阻止一些挥发或分解吧，延长使用“寿命”。
2、一般的书上都说显影液只能用一次，其实完全不至，我一般都是至少用2次，根本一点问题都没有。还有固定液和染色液也可以适当多用几次，只要能然出来就行。
3、有的时候实验室用超纯水so多，也so浪费，或是一时半会制不出来，而染色要用怎么办呢，我无意中就用蒸馏水代替，什么问题都没有，根本没啥差别，甚至于后来我压根都不用蒸馏水了，干脆改自来水，也没啥问题，完全可行，不信大家可以试试，呵呵，虽然说是可能某些地方不是很合理，但对一般像做分子标记之类的根本没啥影响，替老板能省就省点吧，大家都不容易，哈哈!
还有我忘了说了，以前经常跑完胶后来不及染色就得回寝室了，怎么办呢，不用熬夜，就把胶剥离下来泡在固定液里，第二天早上再来接着下面的步骤一点问题都没有，就是可能胶尺寸会有些变化，但绝对不影响你的结果。
最后一个就是读带问题，我见过别人好多种方法，但我自己“发明”了一种实用、准确的：
找一块大点的普通玻璃板(我当时用的是跑大垂直板胶的），带上手套（保护好自己，虽然聚合后毒性小，但还是有的），快速把胶捞出来，放在玻璃板上，再迅速把玻璃翻个面，平放在观片灯上，只要你速度快，胶是不会掉下来的，会紧紧贴在玻璃上的，最好玻璃板和管片灯的平面有点空隙，否则胶粘住观片灯表面就会把灯面弄脏，胶也可能会掉，一切弄好后，你就可以直接那笔在玻璃的这个干净面上一清二楚的读带，直接可以往上面写带型，然后为了以后检查用，最好用数码相机快速拍照保存，不但胶上的带可以看清，你在玻璃上写的带型数字也是非常清楚的，当然读完的胶就可以立即扔掉，没必要保存
14、做实验时，认真做好记录，写好实验结果，过一段时间再去看看，温故而知新
15、有些时候做完ＰＣＲ，由于条带很淡，但你想回收．不妨将有目的条带的胶切下来．放到－２０度冻一会，拿出吸它的液体作摸板，再扩增效果很好！！
16、做转染，我养过四五种细胞，都做了转染，但每种的转染率都不一样，本人当时就吃了这个亏，提醒大家，谁做转染事前先查一下要转的细胞转然率怎么样。
还有就是我在用脂质体2000做转染时，一次发现转染6小时后的液体打到其他细胞里仍可以转进去，所以为了提高转染率，我以后在6小时的时候都没有把转染液体打出去，只是又加了含血清的培养基。
   但有一个问题就是，不打出去的话，细胞会死很多，这个也与养的细胞种类，状态都有关。
17 PCR预混:预混一般根据样品的多少，一般我在预混的时候大概每个样品管中预计损失0。5－0。6微升，这样计算需要的总的预混液数量，比较合适。
18、做实验前  一定先写出步骤和列出实验所需要的试剂和器材，下面看看哪些是要购买的，哪些是需要清洗的，哪些是要前处理的 如过滤、高压。
定试剂一定要打提前量，不好买的试剂一定要在3周左右前订购，如在SIGMA订货。
实验的时候一定要坐好标记！！什么时间，多少浓度，如PH值,是否过滤了，
做完实验有写离心或过滤的残液，先不要丢弃，万一实验失败，还要重复的。
实验中的每个环节都很重要
忽略任何一个都可能导致实验的失败
每个人在实验中都有自己的一些好的细小的习惯
例如tip头吸完后马上从移液器上取下来，以免忙乱的时候又以同一tip汲取另一种试剂
用完量桶或者烧杯后，及时清洗，并放入烘箱。
不管大小实验，做完后都要认真做记录。
一个枪头如果可以连续吸两次的话，也不能吸，主要是第二次吸时不准，同时也不能完全打出来。
做完实验擦干桌子，一切东西归位，有些东西可以回收的就回收，很多实验室的枪头是回收的
实验前认真设计，作实验时不胡思乱想，叽叽喳喳，做完后在海阔天空，认真分析试验数据
做之前认真设计,做时就不要老是想着结果,平心静气,注意细节，认真记录，因为失败是常事，不要回过头不知道该从哪里找原因。
每次的实验结束，要及时做好记录，不要等。好记性不如烂笔头，这虽然是俗语，但是不要放弃笔的重要性！
加入试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均
做完实验，清理实验台，以便下次能够更快、更好，更方便的继续工作！药品归位，仪器归位！
做实验一定要有计划,最好在有部分实验数据出来时,就着手写文章,这个不是为了出文章,而是在写文章的时候,可以清晰自己的思路,知道后面该先做什么,该重点做什么.不然有时候辛苦半死,数据太分散,不能说明问题.
不轻易用别人的东西，用时先打招呼，记录要详细，配液体时要记录试剂的批号等?
所有的东西都要即时标记好，日期，药品名称，浓度，等
移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性。
不用酶标枪时不要一直拿在手里，不可以倒过来（特别是里面还有液体的时候）
不要一直说话、聊天~~
笔记要全~要多全有多全~
还有一点很关键，笔记要放好，最近我的笔记掉了~哭死
最后，做完实验要洗手~
离开实验室前或进入实验室前注意水，电是否安全
试验之前看资料的时候，最好规类存放，看过后记下重点内容，并将出处标明，以免日后找不到
一定要记着关水浴箱，切记切记。

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DNA remains in the gel
5.1. Poorly formed gel wells
Remove the gel comb only after complete polymerization of the gel. Pour the buffer onto the gel immediately.
Rinse the wells with electrophoresis buffer to remove urea from denaturing polyacrylamide gels prior to loading the sample.
5.2. Excess DNA loaded
Follow the recommendations for loading described in the certificate of analysis of the DNA ladders/markers (~0.1-0.2 µg per 1mm gel lane width). If possible load the same quantity of the sample.
5.3. Contamination of the DNA sample
Make sure that your sample DNA solution does not contain any precipitate.
5.4. Gel shift effect
The presence of DNA binding proteins in the sample, such as ligases, phosphatases or restriction enzymes may alter DNA migration in the gel and cause the DNA to remain in the gel wells.
Lambda DNA or other DNA with long complementary overhangs may anneal resulting in an atypical band migration pattern.
To eliminate these effects, use 6X DNA Loading Dye & SDS Solution which is supplemented with 1% SDS to eliminate DNA-protein interactions and to prevent annealing of DNA molecules via long cohesive ends.
Always heat these samples with SDS at 65°C for 10 min, chill on ice, spin down and load.

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Curved DNA bands
4.1. Gel incompletely immersed in electrophoresis buffer
Electrophoresis buffer should completely cover the entire gel during sample loading and run.
4.2. Low sample volume
The sample or the ladder volume should be large enough to fill 1/3 of the total capacity of the well. Large wells should not be used with small sample volumes. If needed the sample volume can be adjusted with 1X loading dye.
4.3. Improper electrophoresis conditions
Do not use an excessively high voltage for electrophoresis. Run the gels at 5-8 V/cm. To minimize band curving, use a lower voltage for several minutes at the beginning of electrophoresis.
For fast electrophoresis under high voltage (up to 23 V/cm) use GeneRuler™ or O'GeneRuler™ Express DNA ladders.
To calculate the optimal electrophoresis conditions (voltage) and to use the recommended V/cm value (which is in many cases 5-8 V/cm, depending on the ladder) one has to:

    measure the distance between electrodes (cathode and anode) – X, cm,
    and multiply the X value by the recommended voltage (Y, V/cm),
    the result (X x Y) is the recommended voltage to be applied.

4.4. Bubbles or physical particles in the gel wells or in the gel
Use pure water, clean flasks and clean equipment for preparation of gels.
Pour the gel slowly avoiding formation of bubbles. Bubbles can be removed with a pipette tip.

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3. Atypical banding pattern
3.1. Lambda DNA marker was not heated prior to loading
All DNA markers generated from Lambda DNA, as well as lambda DNA digestion products should be heated at 65°C for 5 min and chilled on ice before loading on the gel in order to completely denature the cohesive ends (the 12 nt cos site of lambda DNA) that may anneal and form additional bands.
3.2. Denatured DNA
Excessively high voltage may result in gel heating and DNA denaturation.
To calculate the optimal electrophoresis conditions (voltage) and to use the recommended V/cm value (often 5-8 V/cm, depending on the ladder) one has to:

    measure the distance between electrodes (cathode and anode) – X, cm,
    and multiply that X, cm value by the recommended voltage (Y, V/cm),
    the result (X, cm x recommended Y, V/cm) is Z – recommended voltage to be applied.

For non-denaturing electrophoresis use the loading dye solutions supplied with every Fermentas DNA ladder/marker, as these solutions do not contain denaturing agents.
Prepare DNA ladders and probes according to recommendations.
Do not heat them before loading. Heating is required only for lambda DNA markers.
3.3. Different loading conditions for the sample and the ladder DNA
Always use the same loading dye solution (supplied with the DNA ladder/marker) for both the sample DNA and the ladder/marker DNA.
If possible always load equal or very similar volumes of the sample DNA and the ladder/marker DNA. The sample can be diluted with 1X loading dye.
3.4. Improper electrophoresis conditions
Excessive electrophoresis run times or voltage may result in migration of small DNA fragments off of the gel. Very short or slow electrophoresis may result in incompletely resolved bands.
Run gels at 5-8 V/cm until the bromophenol blue passes 2/3 (orange G, 4/5) of the gel. Refer to General Recommendations for DNA Electrophoresis for migration of tracking dyes in different gels.
For fast electrophoresis under high voltage (up to 23 V/cm) use GeneRuler™ or O'GeneRuler™ Express DNA ladders.
3.5. Incorrect gel percentage or running buffer used
TAE buffer is recommended for analysis of DNA fragments larger than 1500 bp and for supercoiled DNA. TBE buffer is used for DNA fragments smaller tha 1500 bp and for denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Large DNA fragments will not separate well in TBE buffer.
The correct gel percentage is important for optimal separation of the ladder DNA; prepare gels according to recommendations. When preparing agarose gels always adjust the volume of water to accommodate for evaporation during boiling. Otherwise, the gel percentage will be too high and result in bad separation of larger DNA bands.
Refer to General Recommendations for DNA Electrophoresis for the range of effective separation of DNA in different gels.
Ethidium bromide interferes with separation of large DNA fragments. Do not include ethidium bromide in the gel and run buffer when large DNA (more than 20 kb) or supercoiled DNA is analyzed. Stain the gel following electrophoresis in a 0.5 µg/ml ethidium bromide solution for 30 min.
3.6. Atypical migration due to different DNA sequence or structure
During high resolution electrophoresis DNA fragments of equal size can migrate differently due to differences in DNA sequences. AT rich DNA may migrate slower than an equivalent size GC rich DNA fragment. The sequences of Fermentas DNA ladders are chosen to allow for highly accurate DNA migration according to size, however, due to differencies in nucleotide sequence or the overall DNA structure, sample migration can sometimes slightly differ from ladder band migration.
DNA structures such as nicked, supercoiled or dimeric molecules will always show different mobility on gels compared to an equivalent DNA size standard. See the picture below for migration of plasmid DNA forms:

Figure. Migration of plasmid DNA forms

    GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder
    Undigested plasmid pUC19 DNA (2,7 kb), forms:
        upper band (~4 kb) – dimeric plasmid,
        below, less visible (~3.5 kb) – nicked plasmid,
        lowest band (~1.9 kb) – supercoiled plasmid.
    Linearized plasmid pUC19 (2,7 kb) – migrates according to its size.


High level DNA modifications such as methylation, labeling with biotin or large fluorescent molecules also result in slower migration compared to unmodified DNA of the same size.
3.7. Gel shift effect
The presence of DNA binding proteins in the sample, such as ligases, phosphatases or restriction enzymes may alter DNA migration in the gel or cause the DNA to remain in the gel wells.
Lambda DNA or other DNA with long complementary overhangs may anneal resulting in an atypical migration pattern.
To eliminate these effects, use 6X DNA Loading Dye & SDS Solution which is supplemented with 1% SDS to eliminate DNA-protein interactions and to prevent annealing of DNA molecules via long cohesive ends.
Always heat these samples with SDS at 65°C for 10 min, chill on ice, spin down and load.
High salt concentration in the sample may also cause gel shift effects, see 3.8.
3.8. High salt concentration in the sample
Samples with a high salt concentration may give smeared or shifted band patterns.
Ethanol precipitation and washing the pellet with ice cold 75% ethanol or spin column purification prior resuspending DNA in water or TE buffer, helps eliminate salt from the sample.

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核酸电泳   Smeared DNA bands (弥散带）
2.1. DNA degradation by nucleases
Use fresh electrophoresis buffers, freshly poured gels, nuclease free vials and tips to minimize nuclease contamination of DNA solutions.
2.2. Improper electrophoresis conditions
Prepare gels according to recommendations, always use the same electrophoresis buffer for both preparation of the gel and running buffer.
Make sure that the whole gel is immersed completely in the electrophoresis buffer during the run.
Do not use an excessively high voltage for electrophoresis. Run the gels at 5-8 V/cm. To increase the band sharpness, use a lower voltage for several minutes at the beginning of electrophoresis.
For fast electrophoresis under high voltage (up to 23 V/cm) use GeneRuler™ or O'GeneRuler™ Express DNA ladders.
An excessively low voltage during the entire run may result in diffusion of bands during electrophoresis. Excessively high voltage may result in gel heating and DNA denaturation.
To calculate the optimal electrophoresis conditions (voltage) and to use the recommended V/cm value (usually 5-8 V/cm, depending on the ladder) one has to:

    measure the distance between electrodes (cathode and anode) – X, cm,
    and multiply that X, cm value by the recommended voltage (Y, V/cm),
    the result (X, cm x recommended Y, V/cm) is Z – recommended voltage to be applied.

2.3. Gel shift effect
DNA binding proteins, such as ligases, phosphatases or restriction enzymes may alter DNA migration on gels and cause the DNA to remain in the gel well or gel shifting.
Lambda DNA or other DNA with long complementary overhangs may anneal and migrate atypically.
To correct for the above mentioned effects, use 6X DNA Loading Dye & SDS Solution which is supplemented with 1% SDS to eliminate DNA-protein interactions and to prevent annealing of DNA molecules via long cohesive ends.
Always heat these samples with SDS at 65°C for 10 min, chill on ice, spin down and load.
2.4. Excess DNA loaded
Follow the recommendations for loading described in the certificate of analysis of the DNA ladders/markers (~0.1-0.2 µg per 1 mm gel lane width). If possible apply same requirements for DNA quantities for the samples as well.
2.5. High salt concentration in the sample
Samples containing high concentrations of salts may result in smeared or shifted band patterns.
Ethanol precipitation and washing the pellet with ice cold 75% ethanol or spin column purification prior to resuspending the sample in water or TE buffer helps eliminate saltspresent in the sample.
2.6. Poorly formed (slanted) gel wells
When inserting the comb into the gel, make sure that it is vertical to the gel surface and stable during gel casting and its solidification.

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DNA Electrophoresis(核酸电泳）
1. Low intensity of all or some of the DNA bands （所有泳带不亮，或部分不亮）
1.1. Insufficient amount of ladder was loaded （上样量不足）
Follow the recommendations for loading described in the certificate of analysis of the DNA ladders/markers (~0.1-0.2 µg per 1 mm gel lane width).
1.2. Insufficient or uneven staining （染色不均匀）
Following electrophoresis, visualize DNA by staining in ethidium bromide solution (final concentration 0.5 µg/ml) or SYBR® Green I.
Alternatively, if the DNA will not be used for cloning, add ethidium bromide to both the gel and electrophoresis buffer at a final 0.5 µg/ml concentration.
After alkaline agarose gel electrophoresis the gel should be immersed for 30 min in 300 ml 0.5 M Tris-HCl buffer, pH 7.5 and only later stained in a 0.5 µg/ml ethidium bromide solution for 30 min.
After denaturing polyacrylamide gel electrophoresis with urea, soak the gel for about 15 minutes in 1X TBE to remove the urea prior to staining. Stain the gel in 0.5 µg/ml ethidium bromide in 1X TBE solution for 15 min.
Make sure that the gel is immersed completely in the staining solution.
1.3. DNA run off the gel （核酸飘出上样孔）
Perform electrophoresis until the bromophenol blue dye passes 2/3 (orange G, 4/5) of the gel. Refer to General Recommendations for DNA Electrophoresis for migration of tracking dyes in different gels.
Make sure that the entire gel is immersed completely in the electrophoresis buffer during the run. Make sure that gel and apparatus are positioned horizontally during the run.
1.4. DNA diffusion in the gel （核酸已经在胶里面扩散）
Avoid prolonged electrophoresis or excessive staining and destaining procedures as this may cause diffusion of smaller DNA fragments in the gel.
Avoid long term storage of the gel before taking a picture, as this may cause diffusion of DNA fragments and low band intensity.
1.5. DNA masking by electrophoresis tracking dyes（颜色指示剂掩盖dna.)
Do not exceed the amount of electrophoresis tracking dyes used for sample/ladder preparation. Use the loading dye solutions supplied with every Fermentas DNA ladder/marker, as these solutions contain equilibrated amount of tracking dyes which will not mask DNA under UV light.
Prepare DNA ladders and probes according to recommendations.

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菌落PCR。。。。。。
菌落电泳。。。。。

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多基因克隆方法（多DNA片段组装）
To construct the final plasmid from the six starting materials (gene 1–4, replication origin and a selectable marker), SFs are first prepared by linking every two materials together, usually suing overlap-extension PCR (OE-PCR). So as shown in this figure, every SF has its 3′-half overlapped with the 5′-half of the next SF and the 5′-half of the first SF overlaps with the 3′-half of the last SF. A mixture of these SFs was denatured at 100°C to free all single strands. When it cools back down to room temperature, annealing between the overlaps would assemble the single strands one after another into a cycle which can be further repaired into double-stranded, closed circular molecule after transformation into the cells.
http://www.plosone.org/article/i ... ournal.pone.0030267

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PCR-after-ligation method for cloning of multiple DNA inserts
From  Sciencedirect
http://www.sciencedirect.com/sci ... i/S0003269710002198

Outline of the PCR-after-ligation method for efficient multiple DNA insert cloning. The DNA inserts and vector are digested with restriction enzymes to obtain compatible termini, followed by purification and ligation (step 1). Most of the products obtained should be either non-full-length DNA fragments or inverted repeat fragments by self-ligation. Then PCR is performed to amplify ligationproduct using flanking primers, and the DNA fragment with expected size is obtained by gel purification (step 2). The purified DNA fragment is inserted into the linearized vector, followed by transformation into E. coli (step 3).


Agarose gel shows the products obtained from PCR-after-ligation. Lane M: DNA size marker; lanes 1–3: PCRproducts amplified by using the ligationproducts with different molar ratios of vector/inserts as templates. The molar ratios of vector/inserts for lanes 1, 2, and 3 are 1:1:1:1:1, 1:2:3:4:5, and 1:3:1:3:1, respectively.

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Gel extraction of DNA fragments running close together on your agarosegel
from fermentas

If the DNA fragment you would like to extract from a Gel is covert or run very close to a second DNA fragment you can perform a restriction digest with your DNA fragments before loading them on the gel. With the FastDigest® Restriction enzymes in a 5 min reaction.
Choose a restriction enzyme which only cuts in the DNA fragment you are not interested in. The fragment will now be much smaller and will not migrate together with your DNA fragment of interest any more. It is much easier to extract.
You can use the REviewer™ tool on the Fermentas homepage to paste in both sequences and analyse easy what FastDigest® enzyme to choose.

Closely running fragments can not be extracted without contamination

Digestion of second fragment leads to clear separation of fragment of interest

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General recommendations to avoid RNase contamination

From fermentas

    Maintain a separate area, dedicated pipettors and reagents when working with RNA.
    Wear gloves when handling RNA and reagents to avoid contact with skin, which is a source of RNases. Change gloves frequently.
    Use sterile, RNase-free plastic tubes.
    Treat water and all solutions used for RNA purification and handling with DEPC. Add DEPC to 0.1% (v/v) final concentration; incubate overnight at room temperature and autoclave.
    High quality reagents must be used for buffer solutions. Buffers containing Tris should be prepared by dissolving Tris base in DEPC-treated water. Solutions containing DTT or nucleotides should be prepared using DEPC-treated water and be passed through a 0.2 µm filter for sterilization.
    Keep all kit components sealed when not in use and all tubes tightly closed during the transcription reaction.

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PCR product clean-up prior to sequencing
From fermentas

The clean-up reaction removes unincorporated primers and degrades unincorporated nucleotides. The resulting PCR product is ready to use for sequencing without additional purification, e.g., using column purification kits.


    Prepare the following reaction mixture:
    PCR mixture (directly after completion of PCR)         5 µl
    Exonuclease I (#EN0581)         0.5 µl (10 u)
    FastAP™ Thermosensitive Alkaline Phosphatase (#EF0651) or
    Shrimp Alkaline Phosphatase (#EF0511)         1 µl (1 u)

    Mix well and incubate at 37°C for 15 min.
    Stop the reaction by heating the mixture at 85°C for 15 min.

Note

    Up to 5 µl of purified PCR products can be used directly for DNA sequencing without further purification.
    For reliable sequencing results there should not be non-specific PCR products.
    The protocol may be applied for clean-up of PCR products, generated by any thermophilic DNA polymerase or polymerase mix.
    The procedure is not recommended for downstream cloning applications.

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Determination of RNA fragment lenghts in Northern Blots without labelled markers
From Fermentas

1.) Load the RNA marker on the Northern Gel beside your samples

Important: Use the same loading dye for the marker and your samples AND load same volumes. Adjust the volumes with DEPC water

2.) Run the gel and blot the RNA. Crosslink the RNA on the membrane
3.) Cut off the marker lane

Possibility A: Staining with methylene blue

4.) Put the membrane containing the marker lane into a clean, flat bowl. Add methylene blue solution. The membrane must be completely covered (ideally, the gauge should be around 0.8 cm)

5.) Shake the bowl very carefully for about 5-10 min

6.) When the RNA marker bands appear blue, discard the methylene blue solution and wash the membrane with tap water (optionally, 2 x 30 s). The methylene blue solution can be reused several times (store at 4°C)
7.) The marker lane can be a) scanned beside the developed blot or b) mark with a pen the marker bands on the blot (pen writings are mostly visible on fluorescence scanners)
Methylene blue solution: e.g. the Methylene blue solution from MRC (Molecular Research Center), distributed by Fermentas

Possibility B: Visualizing with UV light

4.) Put the membrane containing the marker lane on an UV screen. Mark with a pen the
marker bands and the marker lane can be scanned beside the developed blot

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本帖最后由 donggua 于 2012-4-26 20:19 编辑


连接产物电泳：来自fermentas
Analysis of ligation products by agarose gel electrophoresis

Ligation efficiency can be assessed by agarose gel electrophoresis of ligation reaction products. For sample loading, usage of SDS-supplemented loading dye, e.g., 6X DNA Loading Dye & SDS Solution (#R1151) is recommended to eliminate band shift due to T4 DNA ligase binding to DNA.

    Prepare the loading mixture:
    Ligation reaction product         10 µl
    6X DNA Loading Dye & SDS Solution (#R1151)（可以自己配）         2 µl
    Heat the sample for 10 min at 65°C and load.

Analysis of ligation reaction products on an agarose gel

ligation reaction         400 ng of vector and insert in total were used. Real ligation experiments normally use less DNA, therefore bands on a gel may appear at lower intensity.
M – GeneRuler™ DNA Ladder Mix (#SM0331).
1 – Mixture of DNA insert and vector in T4 DNA Ligase Buffer.
2 – Mixture of DNA insert and vector after the ligation sample loaded with 6X DNA Loading Dye (#R0611).
3 – Mixture of DNA insert and vector after the ligation sample loaded with 6X DNA Loading Dye & SDS Solution (#R1141).

Interpretation of results


    Appearance of higher molecular weight bands and decreased intensity of the vector and insert bands indicate successful ligation.
    Unchanged band pattern after ligation indicates unsuccessful ligation.