[转移帖]检测药物作用HepG-2.2.15细胞上清液中HBV DNA的含量

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原帖由bowen9177 发表于 2010-9-3 10:06

小弟不才，检测药物作用HepG-2.2.15细胞上清液中HBV DNA市面上有相应的荧光定量PCR 试剂盒，但是苦于试剂盒太贵，实验室经费又紧张，各位同仁，有没有比较物美价廉的方法呀？
还有就是拿什么来替代阳性标准品做标准曲线，需要做内参的标准曲线吗？

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henshore发表于 2012-12-1 16:23 ：

To 3楼 bowen9177

sybr green的方法也是可以的，但是推荐你用个tiangen的病毒基因组提取试剂盒（主要是便宜，qiagen也有）提取上清中的HBV基因组，这样适用于病毒拷贝数比较低的情况。然后sybr green的方法一样可以做到很精确，效果也很好，sybr和taq-man两种方法我都试过，没多大区别

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bigben 发表于 2012-9-5 22:21 ：
贴细胞图片和传代过程

我前段时间也为HepG2系列（HepG2，HepG2.2.15。。。）头痛
后来发现主要问题是HepG2系列细胞特别粘，细胞特别容易成团
增加胰酶消化时间，100转离心5s去除不可吹散的细胞团基本解决问题

还有一个问题是，如果细胞之间有很多颗粒样的东西，容易成“丝”，很可能是支原体污染
优先选择是重新购买复苏未污染的细胞，当然也可以买支原体去除试剂，比如说Plasmocin™ treatment，我用它救活过一株细胞系  

to 楼上：

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流氓哥哥 发表于 2012-9-4 23:31

To bigben
楼主哪个实验室的，2215我们老养不好。

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bigben发表于 2012-9-4 21:00 ：

1,不要做内参，是绝对定量
2，质粒操作方便（扩增定量）
3，上清中没有cccDNA，只有肝细胞内存在，血液细胞上清里面都是rcDNA
4，如果要区分检测cccDNA，可以针对rcDNA的缺口设计引物+绿豆核酸酶处理降解rcDNA，有很多文献，比如：
赵克开, 细胞内乙型肝炎病毒cccDNA定量检测方法的建立及应用, 2004, 第二军医大学.

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bowen9177 发表于 2010-9-7 20:51 ：

2# yaoming
谢谢斑竹的热心解答，可能我理解的内参和您理解的有点不一样，一般我们用GADPH或者是B-actin作为内参来校正实验结果，但是这是检测上清液中的HBV DNA 拷贝数，所以就不用做内参了吧。大部分试剂盒都是绝对定量的。
您说用含HBV的质粒来做标准曲线，是不是意味着需要提取HBV基因再连接到质粒上呢，为何不直接拿提取HBV基因做标准曲线呢，假如以S区来设计引物和探针。
再一个问题是，上清液中含有很多形式的HBV DNA，不管用哪种方法提取病毒DNA,我们检测拷贝数是针对总体的还是单一的cccDNA或是rcDNA?
谢谢！  

PS。用SYBR  Green  可否替代TaqMan探针，因为实验室一直用的是SYBR  Green。

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yaoming发表于 2010-9-5 18:39：

当然有的！

其实首先就是一个样本的处理问题！请参考这篇中文文章：  裂解液加热煮沸法在血清HBV_DNA抽提中的应用.pdf (165.72 KB) 下载次数: 40

2010-9-5 18:39

然后就是PCR了，用TaqMan探针就ok了。

内参你可以就用一个HBV的质粒，自己定好量，算好浓度。其实你也只知道一个大概的值就可以了，没有必要很准确的！