[转移贴]-第三代测序技术与流感病毒研究

rojjer

原帖由suenmomo 发表于2/11/2010 18:40


第三代测序技术简介
转自sciencenet 作者 廖新化

如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA，并用它来测序，你一定会认为他异想天开，没有一点生物的sense。

我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了！这个就是被称为第三代的测序技术，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time (SMRT™) DNA Sequencing”（单分子实时DNA测序）。

我有幸在NIH听到了这个技术发明人Stephen Turner博士的讲座，根据自己粗浅的理解记录整理一下。


要实现单分子实时测序，有三个关键的技术。

第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。显微镜现在再厉害，也不可能真的实时看到“单分子”。但是它可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。

第二个是纳米微孔。因为在显微镜实时记录DNA链上的荧光的时候，DNA链周围的众多的荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景。这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。Pacific Biosciences公司发明了一种直径只有几十纳米的纳米孔[zero-mode waveguides (ZMWs)]，单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。在这么小的孔内，DNA链周围的荧光标记的脱氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入到孔内又出去，它们形成了非常稳定的背景荧光信号。而当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学键形成，荧光基团被DNA聚合酶切除为止（见图）。
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第三个是共聚焦显微镜实时地快速地对集成在板上的无数的纳米小孔同时进行记录。由于我对显微原理的物理知识匮乏，而Pacific Biosciences公司又没有非常强调在这方面的发明，不做进一步探讨。


他们还对这一技术进行进一步的优化。

第一个是把双链DNA环化反复测序。人们可以在双链DNA的两头连上发夹结构的DNA adaptor，从而使DNA环化。而DNA聚合酶就能够以环化的DNA作为模板滚环复制，反复测一段DNA序列。这种反复测序，纠正了偶尔出现的复制错误，从而使测序精度非常高。

第二个是激发光中断测序法。DNA聚合酶虽然很稳定，但是在强大的激发光作用下酶也是有一定寿命的。如果把激发光中断一段时间，在这段时间内DNA聚合酶继续复制DNA，当激发光重新开启以后，人们就可以测到长DNA链后面的序列。


第三代测序技术非常可怕。1、它实现了DNA聚合酶内在自身的反应速度，一秒可以测10个碱基，测序速度是化学法测序的2万倍。2、它实现了DNA聚合酶内在自身的processivity（延续性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很长的片段），一个反应就可以测非常长的序列。 二代测序现在可以测到上百个碱基，但是三代测序现在就可以测几千个碱基。这为基因组的重复序列的拼接提供了非常好的条件。3、它的精度非常高，达到99.9999%。

此外，它还有两个应用是二代测序所不具备的。

第一个是直接测RNA的序列。既然DNA聚合酶能够实时观测，那么以RNA为模板复制DNA的逆转录酶也同样可以。RNA的直接测序，将大大降低体外逆转录产生的系统误差。

第二个是直接测甲基化的DNA序列。实际上DNA聚合酶复制A、T、C、G的速度是不一样的。正常的C或者甲基化的C为模板，DNA聚合酶停顿的时间不同。根据这个不同的时间，可以判断模板的C是否甲基化。


Pacific Biosciences公司预计2010年或者2011年就会推出商业化的测序仪器。在不远的将来，如果他们能和二代测序一样集成100万个纳米微孔，那么一台仪器15分钟就能够准确地测出一个人的基因组。以后每个人的基因组测序成本将变成100美元，人人都可以消费得起。想想人类基因组计划耗资30亿美元，费时十几年，无数科学家参与其中，技术的革新意义是多么重大啊！


下面引自http://bbs.bbioo.com/forum-viewthread-tid-59659-highlight-%B5%DA%C8%FD%B4%FA%B2%E2%D0%F2.html 说文解字
介绍完三代测序技术之后，请允许我贩卖点私货：

1、创新创新再创新。国内多数导师为了掩饰自己idea的匮乏，极力压制学生的冒险欲望，鼓励学生对一个小的问题花无数的时间用data堆成文章。其实想做真正有挑战性的课题的想法是非常可贵的，导师一个很重要的功能是帮助学生评估他们想法的可行性，在可行的情况下尽量提供条件让他们自己去闯。从想做真正科研的学生的角度来说，让那些不能激动你的保险课题见鬼去吧，花大力气去寻找一些真正能贡献科学，贡献社会的课题，不要害怕一时的挫折，这是科研的真意！

2、不要鄙视公司。有很多人以为学院派的科研是最好的，其实真正推动科学进步的绝不仅仅是发生在学校和研究所的科研。公司同样能做非常令人晕眩的研究，经济意义，社会效益有时候恐怕远甚于学院派研究。美国的许多应用研究就是在公司里面完成的。

3、学科交叉。紧咬你的可贵想法，然后横跨各个学科，自己学或者寻合作者。光是生物背景，想要发明第三代测序技术，那就是个笑话。

rojjer

stare024：
华大就是财大气粗，SOLID4一次买了27台。

我们公司今年5月份刚成立，才有2台

rojjer

zzx219：
RNA的直接测序，将大大降低体外逆转录产生的系统误差。
这个成功应用的话，就使得对RNA病毒的测序的时间和精力都大大降低了。


suenmomo：
查了下，原来早在2003年，斯坦福大学生物工程系的教授Stephen Quake博士成功演示了第一个单分子DNA测序实验。不久以后，Helicos BioSciences公司成立，Quake博士便是创始人之一。Helicos的目标是开发一种能对单个分子进行实时DNA测序的方法。在克服了重重困难之后，他们终于成功了。2008年，第一台单分子测序仪上市，它就是Helicos公司的杰作——HeliScope。

怎么感觉和你报道的不太一样？哪个是正确的？

Illumination：入射光；Emission：激发光；Ion-sensitive layer：离子敏感层；Ion sensor：离子感受器

图示几种第三代测序仪的工作原理。

（a）Pacific Biosciences公司推出的单分子实时DNA测序仪（single-molecule real-time DNA sequencing，SMRT）。如图中所示，在该测序仪里DNA聚合酶被锚定ZMW小孔的底部，当各种不同的被标记的核苷酸通过弥散作用进入ZMW小孔之后，占据了图中白色的探测区域。当核苷酸被掺入到DNA链，即发生了聚合反应时，这些被标记的核苷酸会在小孔的探测区域中被聚合酶滞留数十毫秒。在每一个核苷酸掺入之后，标记在核苷酸末端的磷酸盐会被切除，弥散出ZMW小孔；（b）Life Technologies公司的FRET测序仪，该测序仪使用了荧光标记核苷酸技术。被量子点修饰的DNA聚合酶和DNA模板分子被固定在固体表面。在核苷酸掺入时，能量会从量子点转移到每一个被标记核苷酸的受体荧光分子上，发出荧光，而且只有当核苷酸被掺入时才会发出荧光，同时被检测到；（c）Oxford Nanopore公司的测序仪。该测序仪使用了一个由修饰过的α溶血素蛋白组成的纳米孔（图中紫色所示）。该纳米孔位于一脂质双分子层中，纳米孔中还连接有一个核酸外切酶。当从DNA模板链上被陆续切割下来的核苷酸依次进入纳米孔时，就会与同种蓝色的环糊精分子（cyclodextrin moiety）发生暂时的结合，从而干扰通过纳米孔的电流，每一个碱基都会有其特有的干扰电流产生；（d）Ion Torrent公司的测序仪，该测序仪使用了一种高密度半导体小孔芯片。该芯片置于一个离子敏感层和离子感受器之上，每当有核苷酸分子被掺入时就会释放出质子，而离子感受器就会感受到这种信号，知道是哪一个核苷酸被掺入，从而读出DNA序列。

虽然我们有时将第三代测序技术统称单分子测序，但具体到每个公司的技术原理，还是相差甚远。每个公司的核心技术不一样

但是感觉至今一直还未进行商业模式的推广和应用

Pacific Biosciences已经推出了商业化的Single Molecule Real Time (SMRT)测序仪了，在美国的价格是695,000美元，而且很多公司现在应该都有了产品了

咱们中科院也开过会研究这事了，估计还差很远，最近华大还买了27台solid4的测序仪

rojjer

zzx219：
去年年初就说过了，但是感觉至今一直还未进行商业模式的推广和应用。  


基于纳米孔的单分子读取技术
在纳米孔测序技术中，DNA分子依靠核酸外切酶以一次一个碱基的速度通过小孔。这个酶能清楚地区分出4个DNA碱基编码：A、C、G、T，也可以检测出该碱基是否被甲基化，一个单孔能在大约70天左右测定一个完整的基因序列。
  纳米孔技术不需要荧光标记物并且很可能不需要进行扩增，能直接并快速“读”出DNA，同时足够廉价，使进行大量重复实验成为可能。
  纳米孔公司已经研发出包含几百个纳米孔的芯片，该芯片可以用在一台机器上，快速且廉价地给大量DNA进行排序。

怎么感觉和你报道的不太一样？哪个是正确的？  

rojjer

suenmomo：
由于deep sequencing approach的逐步成熟应用，ncRNA得以进行高通量的测序，后续的功能研究得以实现 对于流感病毒方便的应用现在也越来越多，只是最终测得的RNA的长度方面存在着或多或少的差异，这样的文章现在有不少，可以在pubmed里搜到，提供一篇做参考