Puromycin嘌呤霉素筛选稳定转染细胞

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运输和保存方法

冰袋运输。

4℃干燥保存，1年有效；为了维持最好的产品稳定性，建议-20℃干燥保存，2年有效。

使用方法

1.        建议使用浓度

哺乳动物细胞：1-10 μg/mL，最佳浓度需要杀灭曲线来确定；

大肠杆菌：LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌，使用浓度为125μg/mL。注：使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的pH值调节，而且受宿主细胞本身的影响。

2.        溶解方法

用蒸馏水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/ml的母液，经0.22 μm滤膜过滤除菌后分装于-20℃冻存；也可溶于甲醇，配制成10 mg/ml的储存液。

3.        嘌呤霉素杀灭曲线的确定（以shRNA转染或者慢病毒转导为例）

嘌呤霉素有效筛选浓度跟细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢情况及细胞所处细胞周期位置等有关。为了筛选到稳定表达的shRNA细胞株，确定杀死未转染/转导细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。建议初次做实验的客户一定要建立适合自身实验体系的杀死曲线（kill curve）。

1） Day 1：24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。37℃细胞孵育过夜；

2） Day 2：a）准备筛选培养基：含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）；b）往孵育过夜后的细胞内更换新鲜配制的筛选培养基；之后37℃孵育细胞；

3） Day 4：更换新鲜的筛选培养基，并观察细胞存活率。

4） 根据细胞的生长状态，约2-3天更换新鲜的筛选培养基；

5） 每日监测细胞，观察存活细胞率，从而确定抗生素筛选开始4-6天内有效杀死非转染或者所有非转导细胞的药物最低浓度。

4.        哺乳动物稳定转染细胞株的筛选

等转染含有pac基因的质粒后，细胞在含有嘌呤霉素的培养基中增殖，以筛选出稳定转染子。

1）   细胞转染48h后，将细胞（原样或稀释）置于含有适当浓度嘌呤霉素的新鲜培养基中培养。

注意：当细胞处于分裂活跃期时，抗生素作用最明显。细胞过于密集，抗生素产生的效力会明显下降。最好进行细胞分盘使其密度不超过25%。

2）   每隔2-3天，移除和更换含有嘌呤霉素的培养基。

3）   筛选7天后评估细胞形成的病灶。病灶可能需要额外的一周或者更多时间，这依赖于宿主细胞系和转染筛选效率。注意：每日进行细胞生长状态的观察。嘌呤霉素的筛选至少需要48h，有效浓度嘌呤霉素的筛选周期一般在3-10天。

4）   转移和放置5-10个抗性克隆到一个35mm的培养皿中，用选择培养基继续培养7天。此次富集培养是为日后的细胞毒性实验做准备。

注意事项

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2）嘌呤霉素为有毒化合物，操作时请小心拿放。

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►嘌呤霉素杀灭曲线的确定（shRNA稳定转染细胞株，仅作参考）  嘌呤霉素Puromycin为了筛选到稳定表达待研究shRNA的细胞株，确定杀死未转染/转导细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。所以初次做实验的客户一定要建立适合自己体系的杀死曲线（kill curve） 。（1）24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。细胞孵育过夜； （2）准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）；（3）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞； （4）约2-3天更换新鲜的筛选培养基；  （5）每日监测细胞观察存活细胞比例。嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。（6）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。  ►嘌呤霉素Puromycin筛选稳定转染细胞  （1）day 0：24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，孵育过夜； （2）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲线确定）的新鲜培养基；  （3）day 1：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的病毒颗粒；（加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。）（4）病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基（血清和双抗，如果已经使用双抗。）到细胞内，然后孵育过夜；（5）病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。孵育。（6）约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基；（7）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP表达的水平及所占比例。在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。注：病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞，但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。

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抗生素筛选注意事项：
1) 细胞密度对药物筛选效果有影响。在筛选过程中如果细胞死亡较慢，细胞密度过大时应该及时传代，
保持细胞的密度在60‐80%。由于G418 发挥作用较慢，用G418 筛选初期几乎都是需要传代数次。
2) 细胞筛选正常的表现：
嘌呤霉素筛选：加入嘌呤霉素2‐3 天细胞开始死亡，死亡的细胞脱落漂浮。4‐5 天不再有新的死亡
细胞出现，剩下的细胞开始缓慢生长。如果剩下的阳性细胞很少，大概2 周后形成成团的细胞克隆。
如果阳性细胞较多，会很快恢复生长，抗生素加压下的细胞生长情况和原来筛选前的细胞基本一样。
G418 筛选和嘌呤霉素筛选现象基本一致，但发挥作用较慢。一般7 天左右细胞开始死亡，14 天左
右无新死亡细胞出现。
3) 慢病毒导入的基因整合稳定。在抗生素压力下传代数次后，细胞的外源基因表达基本稳定，以后的
培养过程中一般不需要抗生素维持。